Téma 1: Kultivace bakterií K nastudování (z učebnic, internetu apod.): Pěstování bakterií Úkol 1: Nejdůležitější půdy v klinické mikrobiologii a jejich charakteristika Prohlédněte si vystavené půdy a poznamenejte si jejich typ a vlastnosti podle údajů na kartičkách nebo výkladu asistenta. Nezapomeňte si poznamenat, která půda je tekutá a která pevná a která je nalitá do zkumavky a která do Petriho misky. Název půdy Tekutá/pevná, miska/zkumavka Barva Typ půdy (selektivní, …) Bakterie, pro něž je půda určena* 1. bujon 2. VL-bujon 3. selenitový bujon 4. Sabouraud 5. Löwenstein-Jenssen 6. KA 7. Endo 8. MH 9. NaCl 10. VLA 11. XLD 12. ČA 13. Levinthal 14. Slanetz-Bartley Úkol č. 2: Vliv fyzikálních a chemických podmínek na kultivaci bakterií Závislost růstu bakterií na koncentraci solí a antibiotik Na stole máte misky s několika agarovými půdami; na každé z nich jsou naočkovány tři kmeny, každý na třetinu. Zaznamenejte: ROSTE – NEROSTE Kmen Krevní agar (KA) KA s NaCl (6,5 %) KA s NaCl (10 %) agar s azidem sodným (SB5) KA s ami- kacinem E – enterokok SR – streptokok ST – stafylokok Úkol 3: Krevní agar – viridace a hemolýza Krevní agar lze považovat za půdu obohacenou (o krvinky), je však zároveň i půdou diagnostickou: můžeme na něm pozorovat následující typy změn: úplná hemolýza – bakterie svou činností zcela rozloží erytrocyty ve svém okolí, krevní agar nabude barvy séra, je průhledný částečná hemolýza – bakterie svou činností rozloží erytrocyty jen částečně, krevní agar kolem kolonií je pouze poloprůsvitný a jeho barva je nažloutlá (bez zeleného nádechu) viridace (lat. viridis = zelený) – změna červeného krevního barviva na barvivo zelené, agar v okolí kolonie nabývá zelenavé barvy žádná změna – většina bakterií krevní agar nemění Zaznamenejte hemolytické vlastnosti tří kmenů na krevním agaru. Všímejte si zbarvení okolí kolonie, nikoli zbarvení kolonie samotné. Prohlížejte proti světlu. Streptococcus pyogenes (SRPY) Streptococcus agalactiae (SRAG) Streptococcus pneumoniae (SRPN) Enterococcus faecalis (ECFS) Téma 2: Diagnostika streptokoků K nastudování: Streptococcus (z učebnic, internetu…) Tabulka pro souhrn výsledků úkolů 1 až 6 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S Gramovo barvení – Úkol 1 Kataláza – úkol 2a Slanetz-Bartley úkol 2b Úkol 3 Kulti- vace (krevní agar) Velikost Barva Tvar Profil Změny agaru Jiné DÍLČÍ ZÁVĚR Úkol 4a: Optochin (jen viridující str.) 4b: STREPTOtest 16 (jen ústní strep.) Úkol 5a: PYR test (jen hemolytické s.) Úkol 5b: CAMP (jen hemolytické s.) Úkol 5c (jen nAnB) Aglutinace KONEČNÝ ZÁVĚR Úkol 1: Mikroskopie podezřelých kmenů Na stole máte kmeny označené písmeny. Obarvěte je podle Grama a určete, který z nich není grampozitivním kokem. Nátěry jednotlivých kmenů označte na sklíčku pomocí tužky na sklo příslušným písmenem. Výsledky zapište do tabulky. U kmenů, které nejsou G+ koky, proškrtněte zbylou část tabulky. Úkol 2: Základní kultivační a biochemické testy – rodové určení a) Katalázový test k odlišení stafylokoků Proveďte katalázový test se všemi kmeny z prvního úkolu s výjimkou toho, který jste v tomto úkolu vyřadili. Stafylokoky jsou katalasa pozitivní, streptokoky a enterokoky negativní. Zapište do tabulky. b) Růst na Slanetz-Bartleyově agaru k odlišení enterokoků Na misce máte po výsečích naočkovány všechny kmeny. Roste však jen jeden. Tento kmen je enterokok, a není tedy streptokok. Zapište výsledek do tabulky. Úkol 3: Kultivace na krevním agaru Na miskách s krevním agarem máte opět všechny kmeny. Ty, které jste vyloučili v úkolech 1 a 2, nemusíte popisovat, pro porovnání se však na ně podívejte. Zapište vlastnosti kmenů do tabulky. Nyní zapište do tabulky „dílčí závěr“. Ke každému z kmenů K až S zapište „NENÍ STR“ (není streptokok) „HEMOL STR“ (částečná či úplná hemolýza) nebo „VIRID STR“ (streptokok s viridací) Úkol 4: Bližší určení streptokoků s viridací a) Optochinový test Máte za úkol vyhodnotit optochinový test u dvou kmenů, které jste určili jako streptokoky s viridací. Optochinový test je test, který se ničím neliší od běžného difúzního diskového testu až na to, že účinná látka (optochin) se nyní už nevyužívá léčebně. Kmen s přítomností zóny inhibice růstu kolem disku je S. pneumoniae, kmen bez zóny je „ústní streptokok“. Výsledek zakreslete a zapište do tabulky (tam stačí ve formě + / –) b) Biochemické určení „ústního“ streptokoka U kmene, který jste v předchozím úkolu určili jako „ústního“ streptokoka, druhově vyhodnoťte biochemický mikrotest (STREPTOtest 16), využívajíce postupů, které znáte z jarního semestru. Zkum. První řádek s osmi jamkami Druhý řádek s osmi jamkami VPT 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód: Identifikace Streptococcus ___________ % pravděpod. T index Úkol 5: Určování streptokoků s částečnou či úplnou hemolýzou Tento úkol provádějte u tří kmenů, které jste určili jako streptokoky s betahemolýzou (části a, b, c); poslední část pouze u kmene, který určíte jako non-A-non-B streptokoka. a) PYR test PYR test je proužkový test, podobný oxidázovému. Při odečítání barevné reakce je však nutno asi pět minut vyčkat, pak přikápnout kapku činidla pro PYR test a poté počkat další půlminutu. Pozitivní je zčervenání otisku. Také tento test je pozitivní u S. pyogenes (a také u enterokoků). Negativní je Streptococcus agalactiae i non-A-non-B streptokoky. Poznámka: Někdejší bacitracinový test se dříve používal místo PYR-testu. Jeho princip je shodný s principem optochinového testu, jen s jiným antibiotikem. Pro nedostatečnou specificitu byl již téměř opuštěn. Vyplňte následující tabulku, včetně zakreslení výsledku PYR testu u všech tří testovaných kmenů. Kmen (zapište písmeno) Kmen (zapište písmeno) Kmen (zapište písmeno) Interpretace: negativní – pozitivní Interpretace: negativní – pozitivní Interpretace: negativní – pozitivní b) CAMP test Poznámka: CAMP test nemá nic společného s cyklickým adenosinmonofosfátem. Nazývá se podle jmen svých objevitelů. Proto se také píše CAMP test a nikoli cAMP test. CAMP test je založen na hemolytickém synergismu mezi kmenem S. aureus produkujícím beta-hemolyzin a kmenem S. agalactius. Pozitivní výsledek má tvar dvou trojúhelníkovitých zón („motýlovitý tvar“) úplné hemolýzy v místě překřížení obou kmenů. Malá zóna jiného tvaru se považuje za negativní výsledek. Negativní je jak S. pyogenes, tak i non-A-non-B streptokoky. Nakreslete svůj výsledek do obrázku (na následující stránce): c) Demonstrace aglutinačního testu k bližšímu určení zejména non-A-non-B streptokoků U kmene určeného jako streptokok non-A-non-B by se mohlo provést určení séroskupiny aglutinací. Prohlédněte si na obrázku z dataprojekce výsledek takové aglutinace a zakreslete. Poté zaznamenejte do tabulky výsledky všech částí Úkolu č. 5, a zapište do tabulky definitivní závěr (určení jednotlivých streptokoků). A B C D F G Úkol 6: Testy citlivosti na antibiotika u streptokoků Vyhodnoťte testy citlivosti (difusní diskové testy) na antibiotika u těch kmenů streptokoků, které považujete za patogeny či možné patogeny; předpokládejme pro jednoduchost, že se jedná o kmeny z horních cest dýchacích. Do tabulky dopište zkratky antibiotik dle přiložené kartičky a pro všechny testované kmeny změřte zóny citlivost v mm. Na kartičce jsou napsány hraniční zóny – podle nich interpretujte zóny vámi zjištěné jako citlivé (C), rezistentní (R) a dubiózní (D). Dubiózní jsou zóny, jejichž průměr právě odpovídá referenční zóně. Kmen Antibiotikum (celý název) Æ zóny (mm) Interpr. Æ zóny (mm) Interpr. Æ zóny (mm) Interpr. Æ zóny (mm) Interpr. Úkol 7: Diagnostika pozdních následků streptokokových infekcí – vyšetření ASLO Na bočním stole naleznete ve vlhké komůrce destičku. Obsahuje pozitivní kontrolu a séra 1 až 5. Určete titry a interpretujte z hlediska rizika. (Přesné provedení bylo popsáno v praktiku J08 při probírání neutralizace). Na sérologické destičce odečtěte stanovení hladiny ASLO u kontrolního séra a u pacientů.