Téma 1: Základy biochemické identifikace bakterií Úkol 1: Tvorba sirovodíku, štěpení sacharidů a produkce plynů v půdě Hajnově Tvorbu sirovodíku prokazujeme spolu se zkvašováním cukrů a produkcí CO[2] v kombinované půdě podle Hajny. Substrátem pro tvorbu H[2]S je thiosulfát sodný a indikátorem citrát železitoamonný. Sirovodík vytvořený redukcí thiosulfátu reaguje s ionty železa za vzniku sulfidu železitého. Produkce H[2]S se projeví zčernáním spodní části půdy. S. Typhi dělá jen uzoučký černý proužek na rozhraní šikmé části a plného sloupce. Podle pokynů vyučujícího zhodnoťte štěpení sacharidů a produkci plynů u testovaných kmenů. Výsledky zakreslete a zapište. Úkol 2: Průkaz pohyblivosti, tvorby indolu a štěpení močoviny (MIU) K průkazu těchto vlastností se používá kombinovaná diagnostická půda MIU (motility, indol, urea). Zkoumané kmeny byly do půdy očkovány vpichem. Pohyblivost bakterie se prozradí rozrůstáním z čáry vpichu. K průkazu indolu se přikapávají 2 kapky Kovácsova reagens – v pozitivním případě se na rozhraní půdy a činidla vytvoří červený prstenec. Pokud bakterie štěpí ureu, půda se alkalizuje a barví se do růžova. Zapište vzorec a výsledek štěpení urey: Určete vlastnosti předložených kmenů, výsledky zakreslete a zapište. Téma 2: Dg. některých dalších grampozitivních baktérií (enterokoků, listerií, korynebakterií, bacilů) K nastudování: Enterococcus, Listeria, Bacillus, Corynebacterium (ze skript, učebnic, internetu). Z jarního semestru: Mikroskopie, Kultivace, Biochemická identifikace Tabulka pro hlavní výsledky úkolů číslo 1 až 5 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S Gramovo barvení – Úkol 1 Úkol 2 Kulti- vace (krevní agar) Velikost Barva Tvar Profil Změny agaru Jiné Katalázový test Úkol 3a Slanetz-Bartley Úkol 3b Žluč-eskulinová půda Úkol 3c Arabinózový test Úkol 4a ENCOCCUStest Úkol 4b Růst v ledničce Úkol 5a DEFINITIVNÍ ZÁVĚR* *U G+ tyčinek napište pouze rodové jméno. Druhové určení by vyžadovalo přesnější testy, které nemohou být v praktiku provedeny. Úkol 1: Mikroskopie podezřelých kmenů Na stole máte písmeny popsané kmeny. Obarvěte je podle Grama a výsledky zaneste do tabulky. Nezapomeňte na důležité detaily („tyčinky v palisádách“, „robustní, sporulující tyčinky“ a podobně). Aby nedošlo k záměně, popište sklíčka dermografem. U bakterií, které nebudou grampozitivní, neprovádějte další úkoly. Úkol 2: Morfologie kolonií G+ koků a tyčinek Popište kolonie jako obvykle. V popisu vynechejte gramnegativní bakterie, ale prohlédněte si je pro srovnání. U kmenů, které jste identifikovali jako G+ tyčinky, se pokuste uhádnout, o jakou bakterii by mohlo jít, podle následující charakteristiky: Bacillus – velké, ploché, suché, plsťovité kolonie, „rozlézající“ se po povrchu agaru, někdy s výraznou hemolýzou, jindy zcela bez ní. Mikroskopicky velmi robustní tyčinky, někdy s nálezem centrálně až subterminálně uložených endospór, jež mohou, ale nemusí bubřit tyčinku. Listeria – bezbarvé až našedlé kolonie, velmi podobné enterokokovým, bez hemolýzy nebo s hemolýzou, mikroskopicky drobnější než Bacillus, neuspořádané v palisádách, ale spíše v krátkých řetízcích. Corynebacterium (a blízké rody) – šedavé nebo bělavé kolonie podobné stafylokokovým, ale někdy i o hodně menší, většinou bez hemolýzy; v mikroskopii spíše menší než předchozí, ale kyjovité a uspořádané do palisád. Úkol 3: Některé běžné biochemické a kultivační testy a) Katalázový test Proveďte katalázový test pro všechny kmeny, které jsou G+. Všimněte si, že Listeria, Corynebacterium i Bacillus jsou pozitivní, ovšem některé koryneformní tyčinky jiné než vlastní Corynebacterium (např. Arcanobacterium) jsou kataláza negativní. b) Růst na Slanetz-Bartleyho půdě Na misce máte naočkované tytéž kmeny jako v úkolu 1. Pozitivní jsou ty, které nejen rostou, ale navíc mají typickou růžovou až červenohnědou barvu. Na této půdě rostou pouze enterokoky. Výsledek zapište do tabulky. c) Růst na žluč-eskulinové půdě Na rozdíl od předchozí umožňuje žluč-eskulinová půda nejen růst rodu Enterococcus (to umožňuje rozlišit jej mezi G+ koky), ale také Listeria (diagnostická mezi G+ tyčinkami). V pozitivním případě vidíte černé kolonie. Zapište výsledek do tabulky. Úkol 4: Vzájemné rozlišení enterokoků a) Arabinózový test pro druhové rozlišení dvou nejběžnějších druhů enterokoků Prověřte dva kmeny, které byly určeny jako enterokoky. Prohlédněte si zkumavky s výsledkem arabinózového testu. Žlutá barva znamená pozitivitu (typická pro Enterococcus faecium) a zelená negativitu (typická pro Enterococcus faecalis). b) Biochemický test k druhovému rozlišení enterokoků ze závažných klinických materiálů (je schopen najít více než ony dva nejdůležitější druhy) V závažných případech raději použijeme spolehlivější druhové určení než je orientační určení arabinózovým testem ve zkumavce. Použijeme biochemický test v plastové destičce, v našich podmínkách nejčastěji EN-COCCUStest. Povšimněte si, že i v něm je obsažen test štěpení arabinózy. Odečtěte u obou kmenů z předchozího úkolu biochemický mikrotest podle návodu. Kmen: H G F E D C B A Kód: 1 2 4 1 2 4 1 2 Identifikace: Kmen: H G F E D C B A Kód: 1 2 4 1 2 4 1 2 Identifikace: Úkol 5: Další metody k diagnostice listerií a): Růst listerií při 4 °C Prohlédněte si kmen, který jste předběžně určili jako listerii, a který byl kultivován při chladničkové teplotě. Zapište výsledek testu (roste – neroste) do tabulky. b): Demonstrace růstu Listeria monocytogenes na chromogenní půdě Prohlédněte si obrázek nárůstu listerií na chromogenní půdě. Půda je specifická pouze pro tento druh. V klinické mikrobiologii se chromogenní půdy pro listerie příliš nevyužívají, mají však velký význam v potravinářství. Výsledek: Na půdě s názvem __________ má L. monocytogenes kolonie barvy ___________ Úkol 6: Testy citlivosti enterokoků a grampozitivních tyčinek na antibiotika Na stole naleznete difusní diskové testy citlivosti na antibiotika u kmenů, které jste určili jako Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Listeria sp., a Corynebacterium sp.. Test na Bacillus sp. byste hledali marně – ve většině případů jsou bacily považovány za kontaminaci z prostředí a tudíž nebývají testovány. Do tabulky dopište názvy antibiotik dle přiložené kartičky a pro všechny testované kmeny změřte zóny citlivosti. Na kartičce máte napsány hraniční zóny – podle nich interpretujte zóny vámi zjištěné jako citlivé (C), rezistentní (R) a dubiózní (D). Kmen Antibiotikum (celý název) Æ zóny(mm) Interpr. Æ zóny(mm) Interpr. Æ zóny(mm) Interpr. Æ zóny(mm) Interpr. Úkol 7: Demonstrace Elekova testu Principem Elekova testu je precipitace mezi toxinem z toxického kmene a antitoxinem z papírového proužku, napuštěného antisérem. Jak toxin, tak i antitoxin difundují agarem. Prohlédněte si obrázek výsledku Elekova testu k průkazu toxicity kmene Corynebacterium diphtheriae vypěstovaného z krku pacienta s pseudomembranosní (pablánovou) angínou. Zakreslete (včetně popisu).