Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Logo1me Základy genomiky IV. Přístupy reverzní a přímé genetiky Genetika přímá Jan Hejátko Masarykova univerzita, Laboratoř funkční genomiky a proteomiky Laboratoř molekulární fyziologie rostlin Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika IV. Přístupy genetiky přímé §poziční klonování §využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice ¨anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika ¨metabolického profilu ¨exprese zajímavých genů §identifikace mutovaného lokusu ¨plasmid rescue ¨iPCR Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Genomika III. Přístupy genetiky přímé §Přímá vs. reverzní genetika Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me „Přímě genetický“přístup 1. IDENTIFIKACE FENOTYPU 2. GENETICKÉ MAPOVÁNÍ 3. GENOVÁ IDENTIFIKACE -poziční klonování „Reverzně genetický“ přístup 1.IZOLACE SEKVENČNĚ SPECIFICKÉHO MUTANTA 2. IDENTIFIKACE FENOTYPU 3. PRŮKAZ KAUZÁLNÍ SOUVISLOSTI MEZI INZERCÍ A FENOTYPEM NÁHODNÁ MUTAGENEZE arab Přístupy „klasické“genetiky versus „reversně genetický“ přístup ve funkční genomice Arabidopsis thaliana EMS T-DNA (retro)transposons Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika III. Přístupy genetiky přímé ¨anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Infekce EμMyc myší retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, které vznikly díky aktivaci Pim kináz (ve 40% aktivaci Pim1 a v 15% aktivaci Pim2), molekulární cíle těchto kináz byly neznámé §Využití inzerční mutageneze ve studiu kancerogeneze § Genomika III. Přístupy genetiky přímé §Infekce EμMyc pim1 mutantů retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, které obsahují v 90% inzerci v blízkosti (aktivaci) Pim2 §Infekce EμMyc dvojnásobných mutantů pim1, pim2 retrovirem MoMuLV vede k tvorbě lymfomů, u kterých lze očekávat aktivaci buď některého ze signálních partnerů Pim proteinů (Y), některého z proteinů Pim signální dráhy (X) nebo k aktivaci některé z příbuzných drah vedoucích k lymfomagenezi (Z) Mikkers et al., Nature Gen (2002) ? Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Štěpení genomové DNA a ligace speciálních linkerů, tzv. splinkerett (zvýšení specifity amplifikace) §Izolace genomových oblastí přílehajících k místu inzerce proviru § Genomika III. Přístupy genetiky přímé §První amplifikace pomocí specifických primerů §Druhá amplifikace pomocí „nested“ primerů (zvýšení specificity) Mikkers et al., Nature Gen (2002) §Lokalizace oblastí přiléhajících k protoviru vyhledáváním v anotovaných databázích myšího genomu Devon et al., Nucl Acid Res (1994) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika III. Přístupy genetiky přímé ¨anatomicky nebo morfologicky detekovatelného fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika ¨metabolického profilu Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §hromadná a automatizovaná analýza metabolitů (až 25.000) pomocí GC-MS technik v knihovnách T-DNA mutantů §Metabolické profilování rostlin Genomika IV. Přístupy genetiky přímé-metabolomika a metabolické profilování §identifikace (např. i komerčně) zajímavých mutantů §snadná a rychlá izolace genů pomocí identifikace T-DNA zasažených sekvenci tof-ms GC_MS_metabolomics GC_MS_metabolomics_3 tc_bioanalytics tc_screening tc_bioinformatics §možnost využít i speciální techniky, např. mikrodisekce vasc_bundles_prof GC_MS_metabolomics_2 Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika IV. Přístupy genetiky přímé ¨fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika ¨metabolického profilu ¨exprese zajímavých genů a molekulárních markerů Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me gus6__1_1g1_34__30_318 §analýza expresního profilu (vzorce) daného genu a identifikace mutantů se změnou exprese §Identifikace mutantů se změnou expresního profilu Genomika IV. Identifikace mutantů se změnou expresního profilu immuno_2 insitu ? dotslide3_1 dotslide3_5 §možnost částečné automatizace (virtuální digitální mikroskopie) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me P1010006 P1010011 .slide microscope Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Image_115 01 rodic 27 obr27 41 41-1 Image_127 Genomika IV. Identifikace mutantů se změnou expresního profilu WT Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika IV. Přístupy genetiky přímé ¨fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika ¨metabolického profilu ¨exprese zajímavých genů §identifikace mutovaného lokusu ¨plasmid rescue ¨iPCR Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §popis fenotypu Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis Genomika IV. Přístupy genetiky „přímé“ – využití T-DNA mutageneze Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me fig2 Identifikace mutantního fenotypu §zvlněné listy §chybějící trychomy na listech a na stonku §opožděné stárnutí §keříčkovitý fenotyp (poruchy větvení) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me fig The Mutant Phenotype Identification §Samčí sterilita, poruchy v prodlužování tyčinek (A,B) (porovnej se standardním typem C) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §popis fenotypu Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis Genomika IV. Přístupy genetiky „přímé“ – využití T-DNA mutageneze §identifikace T-DNA mutované oblasti Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Mutant Locus Identification 1. Identifikace oblasti genomové DNA přiléhající k levé hranici pomocí plasmid rescue fig4 §restrikční štěpení (EcoRI) mutantní genomové DNA §religace a transformace §izolace plazmidové DNA z pozitivně selektovaných klonů §identifikovaná sekvence je identická s genem pro NAD7 kódovaným na mtDNA Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Mutant Locus Identification 2. Identifikace oblasti genomové DNA přiléhající k pravé hranici pomocí inverzní PCR (iPCR) §restrikční štěpení (EcoRI) mutantní genomové DNA §purifikace, religace a PCR pomocí T-DNA specifických primerů §klonování a sekvencování RB_flank_map §identifikovaná sekvence nebyla homologní k žádné sekvencí se známou funkcí Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §popis fenotypu Identifikace chromozomální přestavby zodpovědné za keříčkovitý fenotyp u Arabidopsis Genomika IV. Přístupy genetiky „přímé“ – využití T-DNA mutageneze §identifikace T-DNA mutované oblasti §lokalizace T-DNA inzerce v genomu Arabidopsis Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me IGF_BAC Vyhledávání v knihovně IGF-BAC §genomová knihovna obsahující 10,752 klonů s průměrnou velikostí inzertu 100 kb §bakteriální klony uspořádané v mikrotitračních deskách § §knihovna nanesena na nylonové filtry pro hybridizaci s radioaktivně značenou sondou Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me I. Sekvence přiléhající k levé hranici T-DNA § celkem 28 pozitivně hybridizujících klonů § 19 z nich lokalizováno na chromozomu 2 § 18 s podobností k mtDNA II. Sekvence přiléhající k pravé hranici T-DNA § celkem 6 pozitivně hybridizujích klonů § všechny lokalizovány na chromozomu 2 Mapování pomocí IGF-BAC databáze Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me chrom_local Lokalizace genomové T-DNA přiléhající k levé i pravé hranici T-DNA na chromozomu 2 Sekvence přiléhající k pravé a levé hranici T-DNA inversion §pravděpodobně došlo k inverzi téměř celého chromozómu Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika IV. Přístupy genetiky přímé §poziční klonování §využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice ¨vnějšího fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika ¨metabolického profilu ¨exprese zajímavých genů §identifikace mutovaného lokusu ¨plasmid rescue ¨iPCR Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Poziční klonování Genomika IV. Přístupy genetiky přímé-fragmentační analýza a poziční (map-based) klonování §podstatou je kosegregační analýza segregující populace (většinou potomstva informativního zpětného křížení) s molekulárními markery ¨RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ¨RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) ¨AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ¨SSLP (Simple Sequence Length Polymorphism) ¨polymorfizmus délky genomu (PCR produktů) amplifikovaného pomocí specifických primerů ¨polymorfizmus délky restrikčních fragmentů úseků genomu, detekce pomocí Southern blotu (PCR po naštěpení genomové DNA a ligaci adaptorů) ¨polymorfizmus délky náhodně (pomocí krátkých primerů, 8-10 bp) amplifikovaných úseků genomu ¨polymorfizmus délky fragmentů genomu (PCR po naštěpení genomové DNA a ligaci adaptorů) ¨CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) ¨polymorfizmus délky restrikčních fragmentů úseků genomu amplifikovaných pomocí PCR Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me M M m m Col Ler M M m m Ler Ler m m M M Col Col m + M M Col Ler + M Col Ler m M m M + M Ler Ler + M + M Ler Ler + + M M Col Col Col Ler + M + M + + M M ♂ Ler Ler ♀ Col Col m m M M m + Col Ler Příprava mapovací populace Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Rekombinantní analýza – určení procenta rekombinace mezi mutací a molekulárním markerem r [%] = počet chomozomů Col / počet všech chromozomů x 100 marker I – ve vazbě 5 mutantů 1/10x100 = 10% marker II - žádná vazba 6 mutantů 7/12x100 = 58% •Analýza cca 2000 mutantních linií •Určení nejbližšího (ještě) segregujícího markeru •Identifikace mutace pomocí sekvenování Ler Col Ler Col Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Mapa DNA molekulárních markerů Mapa Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Markery pro jemné mapování Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Využití knihoven inzerčních mutantů v postupech přímé genetiky Genomika IV.-shrnutí Přístupy genetiky přímé §poziční klonování §využití knihoven bodových mutantů v přímé genetice ¨vnějšího fenotypu §vyhledávání v knihovnách inzerčních mutantů podle §Přímá vs. reverzní genetika ¨metabolického profilu ¨exprese zajímavých genů §identifikace mutovaného lokusu ¨plasmid rescue ¨iPCR Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Logo1me Základy genomiky V. Metody funkční genomiky Jan Hejátko Masarykova univerzita, Laboratoř funkční genomiky a proteomiky Laboratoř molekulární fyziologie rostlin Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Zdrojová literatura ke kapitole IV: Základy genomiky V. §Plant Functional Genomics, ed. Erich Grotewold, 2003, Humana Press, Totowa, New Jersey § §Surpin, M. and Raikhel, N. (2004) Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nature Reviews/Molecular Cell Biology 5,100-109 § §Zouhar, J., Hicks, G.R. and Raikhel, N.V. (2004) Sorting inhibitors (Sortins): Chemical compounds to study vacuolar sorting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 101, 9497–9501 § Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Genomika V. §Southern blot a DNA molekulární hybridizace §Analýza genové exprese §Metody kvalitativní analýzy genové exprese Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Metody analýzy genové exprese Genomika V. analýza genové exprese §Kvalitativní analýza exprese genů §Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me □Transkripční fůze s promotorovou oblastí §Identifikace a klonování promotorové oblasti genu §příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérový gen (uidA, GFP) §příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a jejich histologická analýza Genomika V. analýza genové exprese pic_1 pic_2 TATA box počátek transkripce promotor 5’ UTR ATG…ORF reportérového genu fig_1 Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Metody analýzy genové exprese Genomika V. analýza genové exprese §Kvalitativní analýza exprese genů §Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj) §Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me □Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s repotérovým genem §Identifikace a klonování promotorové a kódující oblasti analyzovaného genu §příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a kódující sekvenci studovaného genu ve fůzi s reportérovým genem (uidA, GFP) §příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a jejich histologická analýza Genomika V. analýza genové exprese §oproti transkripční fůzi umožńuje analyzovat např. intracelulární lokalizaci genového produktu (proteinu) nebo jeho dynamiku TATA box počátek transkripce promotor 5’ UTR ATG…ORF analyzovaného genu….ATG…ORF reportérového genu….....STOP fig_1 Histone 2A-GFP in Drosophila embryo by PAM Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me §Metody analýzy genové exprese Genomika V. analýza genové exprese §Kvalitativní analýza exprese genů §Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj) §Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem §Využití dostupných publikovaných dat Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me □Analýza exprese pomocí Genevestigator (AHP1 a AHP2, Arabidopsis, Affymetrix ATH 22K Array) Genomika V. analýza genové exprese Genevestigator_AHP1_anat.jpg Genevestigator_AHP2_anat.jpg Genevestigator_AHP1_dev.jpg Genevestigator_AHP2_dev.jpg Genevestigator_AHP1_stimulus.jpg Genevestigator_AHP2_stimulus.jpg Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Logo1me Genomika IV. Diskuse