Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Logo1me Základy genomiky V. Metody funkční genomiky Jan Hejátko Masarykova univerzita, Laboratoř funkční genomiky a proteomiky Laboratoř molekulární fyziologie rostlin Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Zdrojová literatura ke kapitole IV: Základy genomiky IV. §Plant Functional Genomics, ed. Erich Grotewold, 2003, Humana Press, Totowa, New Jersey § §Surpin, M. and Raikhel, N. (2004) Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nature Reviews/Molecular Cell Biology 5,100-109 § §Zouhar, J., Hicks, G.R. and Raikhel, N.V. (2004) Sorting inhibitors (Sortins): Chemical compounds to study vacuolar sorting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 101, 9497–9501 § Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Fenotypové profilování Genomika IV. §metabolické profilování §DNA a proteinové čipy §Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze §ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese §metody mikrodisekce §Metody využívané ve funkční genomice rostlin §PCR §A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin §Příprava transgenních rostlin Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika IV. §Nové trendy §chemická genetika Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika IV. §Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze §ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese §Analýza genové exprese §Metody kvalitativní a kvantitativní analýzy genové exprese Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze Genomika IV. §metoda umožňující izolaci dominantních mutantů prostřednictvím náhodné inzerce konstitutivního promotoru, vedoucí k nadměrné expresi genu a tím odpovídajícím fenotypovým změnám §prvním krokem je příprava mutantní knihovny připravené pomocí transformace silného konstitutivního promotoru nebo zesilovače §následuje vyhledávání zajímavých fenotypů §identifikace zasaženého genu např.pomocí plasmid-rescue Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me TF TF TF 40S 60S TF TF TF TF 40S 60S 40S 60S 40S 60S 40S 60S Genomika IV. aktivační mutageneze TF TF TF Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Izolace genu CKI1 - izolace genu pomocí aktivační mutageneze - mutantní fenotyp je fenokopií exogenní aplikace cytokininů (CKI1, CYTOKININ INDEPENDENT 1) * - Tatsuo Kakimoto, Science 274 (1996), 982-985 * * no hormones t-zeatin K1 K2 plasmid rescue 35S::CK1 cDNA Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika IV. §Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze §ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika IV. §Systémy regulovatelné genové exprese §umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím identifikaci přirozené funkce genu §pOP systém Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me 35S LhG4 pOP TATA CKI1 activator reporter activator x reporter x Genomika IV. systémy regulovatelné exprese, pOP Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me 35S LhGR pOP TATA CKI1 activator reporter activator x reporter DEX DEX +DEX DEX DEX DEX x Genomika IV. systémy regulovatelné exprese, pOP Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me 35S LhGR pOP TATA CKI1 activator reporter activator x reporter DEX DEX +DEX DEX DEX DEX x pOP TATA GUS DEX DEX wt Col-0 4C Genomika IV. systémy regulovatelné exprese Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika IV. §Systémy regulovatelné genové exprese §umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím identifikaci přirozené funkce genu §pOP systém §UAS systém http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Fenotypové profilování Genomika IV. §DNA a proteinové čipy §Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze §ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Fenotypové profilování §DNA a proteinové čipy Genomika IV. §metoda umožňující rychlé porovnání velkého množství genů/proteinů mezi testovaným vzorkem a kontrolou §nejčastěji jsou používané oligo DNA čipy §k dispozici komerčně dostupné sady pro celý genom §firma Operon (Qiagen), 29.110 70-mer oligonulkleotidů reprezentujících 26.173 genů kódujících proteiny, 28.964 transkriptů a 87 microRNA genů Arabidopsis thaliana §možnost používat pro přípravu čipů fotolitografické techniky-usnadnění syntézy oligonukleotidů např. pro celý genom člověka (cca 3,1 x 109 bp) je touto technikou možno připravit 25-mery v pouźe 100 krocích) Affymetrix ATH1 Arabidopsis genome array §čipy nejen pro analýzu exprese, ale např. i genotypování (SNP polymorfizmy, sekvenování pomocí čipů, …) Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika IV. DNA čipy §DNA čipy, analýza výsledků §pro správnou interpretaci výsledků je nutná dobrá znalost pokročilých statistických metod §kontrola na přesnost měření (opakované měření na několika čipech se stejným vzorkem, vynesení stejných vzorků analyzovaných na různých čipech proti sobě) §je nutné zahrnout dostatečný počet kontrol i opakování §kontrola reproducibility měření (opakované měření s různými vzorky, izolovanými za stejných podmínek na stejném čipu-stejné podmínky proti sobě) Che et al., 2002 §identifikace hranice spolehlivého měření nespolehlivé spolehlivé §konečně vynesení experimentu proti kontrole nebo různých podmínek proti sobě – vlastní výsledek §v současnosti je již velké množství výsledků různých experimentů lokalizovaných ve veřejně přístupných databázích Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Proteinové čipy §čipy s vysokou denzitou obsahující řádově 104 proteinů Genomika IV. proteinové čipy §analýza protein-proteinových interakcí, substrátů kináz a interakcí s malými molekulami §možnost použít protilátky – stabilnější než samotné proteiny Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Identifikace proteinů interagujících s cytoplasmatickou částí integrinu αIIbβ3 krevních destiček §exprese cytoplasmatické části jako fůzního peptidu biotin-KVGFFKR Genomika IV. proteinové čipy §analýza vazby s proteinovým čipem obsahujícím 37.000 klonů E.coli exprimujících lidské rekombinantní proteiny §potvrzení interakce pull-down analýzou peptidů i koprecipitací celých proteinů (chloridový kanál ICln) §další využití např. při identifikaci substrátů kináz, kdy substráty jsou navázány na čip a vystaveny působení kináz za přítomnosti radiokativně značeného ATP (768 purif. proteinů ječmene, z nich 21 identifikováno jako subtráty kinázy CK2α, Kramer et al., 2004) Lueking et al., 2005 Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Fenotypové profilování Genomika IV. §příprava transgenních rostlin §Metody využívané ve funkční genomice rostlin §metabolické profilování §PCR §DNA a proteinové čipy §Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze §ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese §metody mikrodisekce §proteomické přístupy §A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §malé nároky na kultivační plochu Arabidopsis thaliana huseníček polní, mouse-ear cress §velké množství semen (20.000/rostlinu a více) § §malý a kompaktní genom, (125 MBp, cca 25.000 genů, prům. velikost 3 kb) § §5 chromozomů §vhodná pro široké spektrum fyziologických experimentů § §velká přirozená variabilita (cca 750 ekotypů (Nottingham Arabidopsis Seed Stock Centre)) Col-0 Columbia 0 Ler-0 Landsberg 0 Ws-0 Wassilewskija 0 http://seeds.nottingham.ac.uk/ 05arab Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Entrez records Database name Direct links Nucleotide 618,539 Protein 118,482 Structure 61 Genome 7 Popset 106 SNP 184 3D Domains 162 Domains 47 GEO Datasets 6 GEO Expressions 61,406 UniGene 25,447 UniSTS 612 PubMed Central 3,864 Gene 30,273 Taxonomy 1 Arabidopsis, významný rostlinný model TAIR, http://www.arabidopsis.org/info/aboutarabidopsis.jsp National Science Foundation, USA,¨, http://www.nsf.gov/bio/pubs/arabid/chap1.htm Počet záznamů v databázi „PubMed“ (MEDLINE) vyhledaných pod heslem „Arabidopsis“ 25.690/36.588 (16.10. 2008/3.11. 2011, nárůst 42%). (Pro srovnání, pod heslem „human“ nalezeno 10 620.405/ 12 236.383 záznamů), nárůst 15%. Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me galls Transformace Arabidopsis prostřednictvím Agrobacteria tumefaciens Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me agrobacterium_transformation_2 agrobacterium_transformation agrobacterium_transformation_3 p35S_CKIi2 Transformace Arabidopsis prostřednictvím Agrobacteria tumefaciens přenos bakteriální DNA do rostlinné buňky Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me cocultivation_scheme Transformace kokultivací listových disků Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Transformace kokultivací kalusů fa1 Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me biolistic_transformation Transformace „nastřelováním“ DNA Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Transformace květenství At_infiltration_1 At_infiltration_2 At_infiltration_3 At_infiltration_4 At_infiltration_5 At_infiltration_6 At_infiltration_7 At_infiltration_8 http://www.bch.msu.edu/pamgreen/green.htm Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me PCR Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika IV. §Nové trendy §pojem chemická genetika – více než 50.000/66.038 záznamů v databázi PubMed (16.10. 2008/3.11.2011, nárůst 32%) §podobně jako v případě gentiky „klasické“ existují i zde přístupy „přímé“ a „reverzní“ §oproti přístupům „klasické“ genetiky není předmětem zájmu gen ale protein §chemická genetika se snaží identifikovat buď cílový protein po chemickém působení a následných fenotypových změnách („přímá“ chemická genetika) nebo naopak chemikálie schopné interakce s proteinem zájmu („reverzní“ chemická genetika) §za tímto účelem jsou prováděna vyhledávání v knihovnách nejrůznějších chemických látek (tisíce položek, komerčně přístupné) §příklad: analýza endomembránového transportu u rostlin §chemická genetika Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika IV. chemická genetika §Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy chemické genetiky §v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům, zprostředkovávaným zejména tzv. endomembránovým transportem (viz film, GFP směřované do ER) §endomembránový transport je důležitým regulačním mechanismem při přenosu signálu a regulaci buněčných procesů secretion_pthways Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika IV. chemická genetika §Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy chemické genetiky §pomocí vyhledávání v „knihovně“ chemických látek byly identifikovány takové, které vedou u kvasinek (S. cerevisiae) k sekreci enzymu (karboxipeptidázy Y), která je normálně transportována pomocí endomembránového transportu do vakuoly §identifikované látky („sortiny“) byly schopny vyvolat obdobné změny i u Arabidopsis (konzervované mechanismy transportu u kvasinek i u rostlin) §analýza změny sekrece pomocí dot-blotu a imunodetekce karboxipeptidázy Y v kulti-vačním médiu pomocí monoklonálních protilátek §pro bližší identifikaci molekulárního procesu ovlivněného jedním z identifikovaných „sortinů“ byla provedena analýza jeho vlivu na sekreci markerového proteinu (AtCPY) – sortin 1 inhibuje specificky pouze tuto sekreční cestu §pomocí EMS mutageneze identifikace mutantů se změněnou citlivostí k sortinu 1 (hyper- nebo hypo-senzitivní mutanti) yeast screen Zouhar et al., 2004 chemická struktura sortinů detekce vakuolárního fenotypu (tvaru tonoplastu) kvasinek pomocí barvení specifickou barvou (MDY-64) Imunodetekce karboxypeptidázy tvar rostlinných vakuol pomocí EGFP:-TIP fenotyp semenáčků v přítomnosti sortinů Sortin 1 Sortin 2 Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika IV. chemická genetika §Analýza mechanismů endomembránového transportu pomocí chemické genetiky - shrnutí §GFP::d-TIP značení mebrány vakuoly (tonoplastu) a identifikace mutací vedoucí ke změně morfologie tonoplastu § §chemická genetika v kombinaci s klasickou genetikou - identifikace proteinů zúčastńujících se regulace endomembránového transportu § §proteomické přístupy – identifikace a analýza proteomu vakuol § Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Fenotypové profilování §metabolické profilování §DNA a proteinové čipy §Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze §ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese §metody mikrodisekce §příprava transgenních rostlin §Metody využívané ve funkční genomice rostlin §A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin §PCR Genomika IV. Shrnutí Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Nové trendy §chemická genetika Genomika IV. Shrnutí Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika IV. Diskuse