Téma 05:    Studium stavby zárodečného vaku metodou projasňování


Pro rychlé hodnocení vývoje zárodečného vaku se v rostlinné embryologii často používají místo
klasických histologických postupů příprav řezových preparátů různé varianty projasňovacích metod,
při kterých se prosvětlí obsah buněk a následně je možné prohlížet vajíčka nebo mladá semena pomocí
optických řezů.  Součástí projasňovacích médií je často chloralhydrát, fenol a kyselina mléčná
(Hoyerovo médium, Herr 1971, Braune et al. 1982, Lux et al. 2005).

Materiál: květenství kokošky pastuší tobolky (Capsella bursa-pastoris L.)

     Carnoyova fixáž

Hoyerovo projasňovací a uzavírací médium

                 destilovaná voda                         25 ml

                 arabská guma                             15 g

                 chloralhydrát                            100 g

                 glycerol                                        8 ml


     Projasňovací a uzavírací médium (Lux et al. 2005)

                 nasycený roztok chloralhydrátu v kyselině mléčné



A.       Pozorování stavby zárodečného vaku kokošky po projasnění chloralhydrátem a kyselinou
mléčnou podle autorů Lux et al. (2005)

Postup:

1.        Fixace vrcholů květenství kokošky pastuší tobolky v Carnoyově fixáži 30 minut až několik
hodin.

2.        Krátký oplach materiálu v 50% ethanolu.

3.        Projasňování v nasyceném roztoku chloralhydrátu v kyselině mléčné v nádobce při
laboratorní teplotě.

4.        Preparace vajíček v kapce projasňovacího média na podložním skle.

5.        Uzavření krycím sklem a  pozorování v mikroskopu v procházejícím světle nebo v Nomarského
diferenciálním interferenčním kontrastu.

Výsledek:

Projasněná vajíčka a mladá semena jsou průhledná a je možné prohlížet tzv. optické řezy.

B.  Pozorování stavby zárodečného vaku kokošky po projasnění v Hoyerově směsi


Příprava Hoyerovy směsi:

1.    rozpustit arabskou gumu v destilované vodě (24 hod)

2.    ve směsi rozpustit chloralhydrát (24 hod)

3.    přidat glycerol a promíchat

4.    pokud je směs příliš hustá, přidat destilovanou vodu


Postup :

1.    Fixovaný materiál převést v sestupné etanolové řadě do destilované vody.

2.    Projasnit postupně v Hoyerově médiu v několika krocích

a)      Hoyerovo médium : voda         1 : 3                 30 minut

b)      Hoyerovo médium : voda         2 : 2                 30 minut

c)      Hoyerovo médium : voda         3 : 1                 30 minut

d)      Hoyerovo médium čisté

3.    Uzavřít vajíčka nebo mladá semena krycím sklem a pozorovat ve fázovém kontrastu nebo
interferenčním mikroskopu.


Výsledek:

Zaostřováním na roviny optických řezů lze sledovat různá vývojová stadia zárodečného vaku a
integumentů ve vajíčkách různého stáří, eventuálně rané vývojové fáze endospermu po oplození.

Hodnocení:

Srovnáme a vyhodnotíme výsledky obou postupů projasňování.


Poznámka:

Chloralhydrát a fenol jsou látky na seznamu nebezpečných chemických látek a vyžadují speciální
zacházení i likvidaci odpadu podle bezpečnostních pravidel.


Literatura:

1.              Braune W., Leman, A., Taubert H. Pflanzenanatomisches Praktikum II. 2. vyd. Jena:
VEB Gustav Fischer Verlag, 1982. 426 s. ISBN 261 700-36-82.

2.              Herr, J. M., Jr. (1971): A New Clearing-Squash Technique for the Study of Ovule
Development in Angiosperms. – Amer. J. Bot. 58/ 8 : 785-790.

3.              Lux A., Morita S., Abe J. et Ito K. (2005): An Improved Method for Clearing and
Staining Free-hand Sections and Whole-mount Samples. – Ann. Bot. 96: 989 – 996.