1. úloha. Pulzní aelová elektroforéza aenomové DNA bakterií Pulzní elektroforéza je elektroforetická metoda umožňující na rozdíl od klasické elektroforézy efektivní dělení molekul DNA větších než 50 kb (až do velikosti několika Mb). Při pulzní elektroforéze se periodicky mění orientace elektrického pole. Při působení elektrického pole se molekuly DNA prodlužují a zarovnávají ve směru elektrického pole a migrují směrem k anodě. Bylo zjištěno, že po odstranění elektrického pole se prodloužená molekula DNA vrací nazpět do relaxovaného stavu. Doba této relaxace závisí na délce molekuly. Periodické změny orientace elektrického pole způsobují relaxaci a opěrné prodlužování a zarovnávání molekul podle orientace nového pole. Princip pulzní elektroforézy je následující: Při působení prvního pole se molekula zarovná ve směru tohoto pole a začne migrovat v gelu. První pole je odstraněno a začne působit druhé pole. DNA musí změnik konformaci a reorientovat se než začne migrovat v druhém el. poli. Čas nutný pro tuto reorientaci (reorientační čas) je velmi citlivý na velikosti molekuly. Větším molekulám trvá reorientace déle než menším. Zatímco větší molekuly se ještě reorientují, menší už mohou začít migrovat gelem. Jestliže doby působení obou střídajících se polí jsou stejné, DNA migruje rovně gelem cik-cak způsobem. Používané termíny: Switch interval (pulzní čas) - doba po kterou je každé ze střídajících se elektrických polí aktivní. Reorientační úhel: úhel mezi dvěma střídajícími se poli. Inverzní pole - Uspořádání pulzní elektroforézy, kdy se střídají pole orientovaná v opačném směru (reorientační úhel je 180°). Používané hmotnostní standardy: konkatemery připravené z DNA bakteriofága X mají obvykle 1-20 -merů (ladder); konkatemery z ligovaných plazmidů; chromozómy Saccharomyces cerevisiae nebo S. pombe Při přípravě vzorků DNA větších než 500 kb je nutné molekuly chránit jak před mechanickým poškozením (působením střižných sil), tak před nukleolytickou degradací během izolace. K tomuto účelu se používá speciální metoda izolace, při které jsou buňky nejprve fixovány v nízkotající agaróze a teprve potom prováděna lyže a purifikace DNA. Princip izolace DNA: Cultured cells Unicellular organisms Tissue Blood Harvest Dissociate Concentrate white cells Wash cell suspension Determine cell concentration resuspend at predetermined concentration Optional digestion of -cell walls Mix cells with liquid low melting agarose and harden in molds Digest with proteinase K with RDTA and detergent Wash samples 1 Store in EDTA Objekt: Kmeny Staphylococcus aureus: Postup: Izolace DNA pro pulzní gelovou elektroforézu (PFGE) 1. 20 ml 2x YT-media naočkovat bakteriální kulturou (z 18 hod. kultury) a inkubovat při 37 °C do OD600 = 0,2 (ca. 1-2 hodiny na třepačce). 2. Přidat 200 |ll 0,5 M EDTA a kulturu zchladit na 4 °C /10 min. 3. Centrifugovat při 3000 min"1, 4°C, 15 min, centrifuga K23. 4. Dvakrát promýt 2 ml promývacího roztoku zchlazeného na ledě (10 mM Tris.Cl, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 7,5) a resuspendovat v 200 |ll stejného roztoku. 5. 100 |ll bakteriální suspenze zahřát v mikrozkumavce na 55 °C (2-3 min.), přidat 7 |ll lyzostafinu ze zásobního roztoku 0,5 mg/ml (lyzostafin přidávat pouze k Staphyloococcus) a smíchat se 100 |ll 2% low melting point agarose (roztok v 50 mM Tris.Cl, 5 mM EDTA, pH 8), předem vytemperované na 55 °C. 6. Suspenzi rychle přepipetovat do komůrek tvořítka po 200 |ll a uložit na 20 min. při 4°C. 7. Vzorky přenést do 1 ml lyzačního roztoku (6 mM Tris.Cl, 100 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5% Brij 58, 0,2% Na-Deoxycholát, 0,5% Laurylsarkosin, pH 7,6), 500 |lg lysozymu (zásobní roztok 50mg/ml), 1 |ig RNasy (zásobní roztok 10 mg/ml). Inkubovat za mírného třepání při 37 °C na vodní lázni 2-3 hod. 8. Lyzační pufr vyměnit za deproteinizační (25 mM EDTA, 20 mM EGTA, 1% laurylsarkosin, pH 9,0) a přidat 500 |lg proteinasy K (zásobní roztok 10 mg/ml). Inkubovat 12 hod. při 55 °C za mírného třepání. 9. 4 - 5 x promýt v 10 ml TE (pH 8,0) při 4 °C. TE pufr vyměňovat po 2 hodinách (za mírného třepání) nebo nechat stát vždy 24 hod. 10. Agarózové vzorky se mohou skladovat 12 měsíců v TE pufru při 4 °C (lx za měsíc vyměnit) nebo delší dobu v 0,5 M EDTA pH 8,0. Reštrikční štěpení velkých fragmentů DNA v agaróze 1. Pro reštrikční štěpení uříznout ca. 1x1x5 mm bloček a přenést do Eppendorf zkumavky. 2. Přidat 10 |ll 10x restrikčního pufru, 85 |ll vody a 5-10 U restriktázy. Inkubovat při požadované teplotě přes noc. Naštěpené vzorky se mohou přímo nanášet na gel. Příprava gelu a nastavení elektroforézy 1. Připravit 1,2% agarózový gel v 1 xTAE pufru 2. Nanést vzorky naštěpené DNA do jamek na gelu a zalít 0,8% low-melting agarózou v lx TAE pufru, vytemperovanou na 45 °C. 3. Optimální podmínky pro rozdělení fragmentů chromozomální DNA (s CHEF-DRII zařízením): Pulzní časy 1 - 90 s, lineární vzestup; Koncentrace agarózy (Lachema) 1,2 %; Teplota 14°C; Napětí 170 V; Doba elektroforézy 28 hod. pro gel délky 14 cm 4. Obarvit gel v roztoku ethidiumbromidu 1 |lg/ml 1 - 2 hodiny, odbarvit v dest. vodě a fotografovat pod UV světlem 302 nm. Poznámky: 1. 2x YT médium: Trypton ...16g, Yeast-extrakt ...lOg, NaCl ...5g, voda do 1000 ml, pH 7,0. 2. Laurylsarkosin sterilizovat filtrací, ostatní roztoky sterilizovat autoklávováním. Úloha: Izolace spontánních mutant rezistentních ke streptomycínu metodou gradientních ploten Princip: Molekulární podstata spontánních a indukovaných mutací je stejná. Liší se však ve frekvenci. Frekvence spontánních mutací je podstatně nižší. Tím se také liší od fenotypové modifikace, neboť ta proběhne prakticky současně ve všech buňkách. Spontánní mutace - rezistence k antibiotikům probíhají dvěma způsoby. Buď se rezistence k antibiotikům vytvářejí postupně v několika stupních (např. u penicilinu) nebo hned v prvním stupni získáme mutanty rezistentní k různým koncentracím antibiotika. Upozornění: očkování provádět ve sterilním prostředí ýlow-boxu; použitý materiál pečlivě roztřídit Objekt: Kmeny Staphylococcus aureus citlivé ke streptomycínu: kmeny S.a .8511-A; S.a. 8511-B; S.a. ISP- A; S.a. ISP- B. Postup: První den. 1. Z 18 hod. kultury vyrostlé na MPA agaru, odebrat 5 kliček a důkladně resuspendovat ve 3 ml MPB. Je nutno vyjít z husté bakteriální suspenze (cca 109 buněk/ml), protože frekvence str11 mutantů je velmi nízká. 2. Z takto připravené husté kultury provést rozsev ze zředění 10"6, 10"7, 10"8 vždy na 3 plotny s MPA, pro stanovení celkového počtu buněk v cm3 (tj. titr buněk). Kultivace při 37 °C/24 3. Připravit gradientní plotny (Obr. 1) se streptomycinem o výsledných koncentracích: 10, 50, 100 a 500 ng/ml. Pro přípravu zásobního roztoku rozpustit 0,5 g krystalického streptomycínu v 5 ml sterilní destilované vody (přidávat do roztavené MPA půdy o teplotě max 55 °C). a odnést do umývárny. hod. Obr. 1 Příprava gradientních ploten 13 ml/PVC misky 15 ml/ skleněné 1. MPA nechat ztuhnout při laboratorní teplotě MPA + streptomycín 2. s 4. Provést rozsevy po 0,1 ml na gradientní plotny (vždy 3 plotny od příslušné koncentrace, viz obr. 2) a pečlivě rozetřít hokejkou po celé ploše. Obr. 2 Stanovení titru buněk rozsev na plotny s MPA 18 hod kultura S aureus Str 5 kliček kultury 3 ml MPB hustá suspenze po 0,1 ml 3* t 10 50 100 500 ng/ml streptomycínu 5. Naočkované plotny inkubovat dnem vzhůru při 37 °C /24 hod Druhý den. Jednotlivé kolonie za linií kompaktního nárůstu přenést do mikrozkumavek s 0,5 ml MPB. Přeočkovat na plotny s různými koncentracemi streptomycínu (5, 10, 25, 50, 100 a 500 ug/ml) formou proužků (viz obr. 3). Příprava ploten: Do známého objemu roztaveného MPA a vytemperovaného na max. 55 °C přidat vámi vypočítané množství zásobního roztoku streptomycínu tak, aby bylo dosaženo požadované výsledné koncentrace. Obr. 3. Gradientní plotna Kompaktní, nárůst MPA + streptomycin 1 proužek = 1 kolonie resuspendovaná * v 0,5 ml MPB 37 °C /24 hod Třetí den. Z výsledků stanovit nej vyšší koncentraci, ke které je kmen rezistentní a určit frekvenci mutací k jednotlivým koncentracím streptomycínu. Výpočet frekvence mutant: F = titr mutant / titr buněk Vypracovat protokol a odevzdat vyučujícímu. Protokol bude obsahovat: Název úlohy; Objekt; Princip metody stručně; Výsledky (titry buněk, titr mutant... .Závěr (hodnocení a diskuze o výsledcích). 3. úloha. Fluktuační test na rezistenci ke streptomycínu a stanovení mutační rychlosti Fluktuační test slouží k tomu, abychom bezpečně rozlišili, zda pod vlivem vnějších změněných podmínek došlo k fyziologické adaptaci nebo zda nová vlastnost buněk je výsledkem spontánní mutace. Necháme-li růst paralelně v několika zkumavkách stejné množství inokula bakteriálního kmene např. citlivého ke streptomycínu po několik buněčných generací a pak vysejeme na plotny se streptomycinem, dostaneme výsledky: a) šlo-li o fyziologickou adaptaci (která je možná až ve styku s faktorem, který ji vyvolává) pak se výskyt rezistentních kolonií na jednotlivých plotnách řídí Poissonovou distribucí a s2= x af %2teor Mutační rychlost udává pravděpodobnost, že buňka bude za určitou dobu v určitém znaku mutovat. Udává se např. jako pravděpodobnost na 1 buňku a 1 generaci. Objekt: Staphylococcus aureus HS 1160 Strs, Staphylococcus aureus 8511 Strs, Staphylococcus aureus ISP8 Strs Úkol: Dokažte, zda vzniklá rezistence ke streptomycínu je výsledkem spontánní mutace nebo fyziologické adaptace. V případě, že se jedná o spontánní mutaci, stanovte mutační rychlost. Schéma postupu: lOmIMPB / \ 18 hod. kultura S. aureus Strs 4 ml KONTROLA I I MPA + 15ng/ml streptomycínu (zás. roztok streptomycínu 100 mg/ml) 46 ml MPB ÍTTTTTTTTTTTTTTTTm po 0,5 ml 24 hod. inkubace při 37 °C a pak vylít celý obsah na plotny 111111111111111 I 11 I MPA + 15 ng/ml streptomycínu -> l=l 20* výsev na MPA+ 15|xg/mlstr. Inkubace 24 - 48 hodin při 37 °C 3* výsev 0,1 ml ve zředění 10"4 10"5 10"6 Kontrola na MPA bez streptomycínu, titr po inkubaci. 4. úloha. Konjugace kmenů Escherichia coli Hfr a F' Konjugace je proces, při kterém je DNA přenášena z donorové buňky do recipientní v důsledku kontaktu buněk a vytvoření konjugačního můstku. Uskutečnění konjugace lze dokázat vznikem rekombinantů, které nemohly vzniknout jinak, než rekombinací mezi genomem donorového a recipientního kmene. Konjugace u E. coli je závislá na přítomnosti a stavu F faktoru. F je plazmid (94,5 kb), který se může autonomně replikovat v buňce nebo integrovat do hostitelského chromozómu. Podle stavu F faktoru se označují příslušné kmeny: Označení Stav F faktoru F F faktor není přítomen v buňce F+ F faktor je přítomen v cytoplazmě F' F faktor nese segment bakteriálního chromozómu Hfr F faktor je integrován do bakteriálního chromozómu Vlastnosti Vhodný recipient během konjugace. Může být přenášen konjugací do recipientní buňky; přenos chromozomálních genů může zprostředkovat při velmi nízké frekvenci. Může být přenášen spolu s asociovaným bakteriálním segmentem chromozómu; může zprostředkovat přenos chromozomálních genů při střední frekvenci v důsledku integrace do chromozómu v homologických oblastech Může přenášet chromozomální znaky při vysoké frekvenci (od pevného bodu na chromozómu, který je charakteristický pro každý Hfr) Objekt: Donor: Escherichia coli HfrH Reich tre+ leu+ pro+ ade+ thi" str5 Recipient: Escherichia coli F" 28R801 tre" leu" pro" ade" thi" stť Do recipientních buněk přechází segment tre+ leu+ pro+ ade+ thi". Marker str zůstává v endogenotu. Postup: 1. Příprava mladých kultur donorového a recipientního kmene: Naočkovat 1 kličku do 20 ml PNS média a inkubovat při 37 °C 18 hodin (do log. fáze růstu). 2. Smíchat kultury donorového a recipientního kmene v poměru 1 : 1 (5 ml + 5 ml) a inkubovat za aerace (při šetrném míchání na vodní lázni) při teplotě 37 °C 3 hodiny. 3. Současně stanovit titr donorového kmene HfrH rozsevem na plotny MPA ve zředění 10"5, 10"6, 10"7, vždy po 3 plotnách. 4. Přesvědčit se, že ani kmen HfrH ani F " nerostou na selektivní půdě. Kontrolu provést výsevem po 0,1 ml kultury zředěné 10"1 na 3 plotny MA + streptomycin 100 |lg/ml + thiamin 5 |lg/ml. Ředění provádět ve fyziologickém roztoku! 5. Po 3 hodinách inkubace vyset neředěnou směs na selektivní půdu po 0,1 a 0,2 ml (vždy po 3 plotnách). 6. Hodnocení pokusu: vyjádřit frekvenci rekombinantů na počet buněk Hfr. Živné půdy: PNS bujón půda pro konjugaci glukóza lg Bacto beef extract 1,5 g Yeast extrakt 1,5 g pepton 5g NaCl 3,5 g K2HP04 3,68 g KH2P04 1,32 g H20 dest. 1000 ml pH 7,2 (i autoklávovat 20 min. /121 °C MPA masopeptonový agar (kompletní půda) MA minimální agar: složka A 1,5% vodní agar, pH 7,2 složka B (4 x koncentrovaný roztok solí) NH4C1 20 g NH4N03 4g Na2S04 8g K2HP04 12 g KH2P04 4g H20 dest. 1000 ml MgS04- 7H20 1,6 ml po autoklávování složka C 20% glukóza - přidat lml na 100 ml MA složka D streptomycin - přidat do konečné koncentrace 100 |lg/ml ze zásobního roztoku 100 mg/ml složka E thiamin přidat do konečné koncentrace 5 |lg/ml ze zásobního roztoku 50 mg/ml Při přípravě MA smíchat složky B (1 díl) + C + D + E, vytemperovat na 45 °C a smíchat se složkou A (3 díly). Příprava minimálního agaru na konjugaci SLOŽKA A vodní agar 180 ml vytemperovat na 47 °C SLOŽKA B roztok solí 60 ml vytemperovat na 47 °C { SLOŽKA C glukóza 2,5 ml SLOŽKA D streptomycin 100 |ag/ ml SLOŽKA E thiamin 5 jag/ ml KONJUGACE Kontrpla na MA + str + thi 10 ředit ve fyziol. rozt. 1 plotna (0,1 ml) Kontrpla na MA + str + th 10 ředit ve fyziol. rozt. 1 plotna (0,1 ml) E. coli HfrH Reich 5 ml Ufr na6LBA 7 10 ,10 ,10 po 3 plotnách (po 0,1 ml) E. coli F- 28R801 5 ml KONJUGACE 37 °C / 3 hod / šetrně třepat I Vysev na MA + str + thi neředěné 3 plotny (0,1 ml) + 3 plotny (0,2 ml)