Téma: Proteiny, Buněčné struktury, poškození DNA Úvod: Během diferenciace buněk dochází k výrazným změnám v expresi a aktivitě celé řady proteinů. Tyto změny mohou být kvalitativní (syntéza proteinu, který v prekurzorech nebyl exprimován) nebo kvantitativní (změna v množství syntetizovaného proteinu). Diferenciace může být také doprovázena změnami v lokalizaci či post-translačních modifikacích určitých proteinů ovlivňujících jejich aktivitu. Cíl: Definovat změny v expresi, lokalizaci a specifické aktivitě vybraných proteinů během makrofágové diferenciace monoblastů BM2. Úloha č.1 Detekce vimentinu v lyzátech monocytů BM2 pomocí elektroforézy proteinů a immunoblotingu Vimentin: Cytoskeletární protein o velikosti 57 kDa. Patří do skupiny intermediárních filament. Exprimován v buňkách mezodermálního původu. Jeho intracelulární hladina se mění během diferenciace některých typů buněk (př. krevní buňky). SDS elektroforéza proteinů: - dělení proteinů dle jejich molekulové hmotnosti (pro určení MW využití markeru) - migrace ovlivněna i modifikacemi proteinů (př. glykosylace …) - nejčastěji se používá diskontinuální systém (rozdílné pH a iontová síla elektroforetického pufru, horního a dolního gelu) - horní a dolní gel (na jejich rozhraní dochází k zakoncentrování proteinů ze vzorku) - gel: polyakrylamid – polymerace akrylamidu, kroslinkováno N,N´-metylen-bis-akrylamidem - dělení proteinů dle MW – koncentrace gelu, počet kroslinků Elektroforetický pufr: Akrylamid a bisakrylamid – neurotoxin (pracujeme v rukavicích) SDS, Tris pufr Ammonium persulfát – poskytuje radikály pro polymerizaci TEMED (tetramethylethyléndiamin) – akceleruje polymeraci akrylamidu Vzorek: SDS se váže na proteiny – ty pak mají záporný náboj Redukční činidlo (merkaptoethanol, dithiothreitol) – disociace proteinových komplexů na podjednotky Barvení proteinů: Soli stříbra (nejcitlivější), Coomassie briliant blue – nespecifická vazba na proteiny Westernův přenos: - polosuchý, ponořený Membrány: nitrocelulóza, PVDF, nylonové membrány - liší se kapacitou vazby proteinů, vážou různě různé proteiny - lze na ní i barvit proteiny (Ponceau S, India Ink, Amido Black …) Protilátky: Primární – monoklonální, polyklonální Sekundární – konjugované s enzymy (HRP, AP …), biotinylované … Substráty: Chromogenní, chemiluminiscence Příprava vzorků: 1x10^6 buněk BM2 inkubovat s forbolovým esterem TPA (7.5 ng/ml kultivačního media) v 5ml misce 24 hod. Zároveň kultivovat stejné množství BM2 buněk jako kontrolu. Buňky promýt 1xPBS a lyzovat v 2xCSB pufru neobsahujícím merkaptoethanol ani bromfenolovou modř, 4 minuty povařit a uchovávat při –20^oC. Změřit koncentraci proteinů ve vzorcích DC Protein Assay kitem (Biorad). Ke vzorkům přidat alespoň dvojnásobek kompletního 2xCSB pufru tak, aby výsledná koncentrace proteinů v takto naředěných vzorcích byla stejná. Měření koncentrace proteinů (DC Protein Assay Kit): Na mikrodestičku pipetovat 5ul každého vzorku ve třech opakováních. Ke vzorkům přidat 25 ul roztoku A´ (obsahuje 20 ul roztoku S na 1 ml roztoku A). Přidat 200 ul roztoku B, zbavit vzorky bublin a ponechat 15 minu stát. Poté změřit absorbanci na ELISA readeru při 750 nm. Vypočítat vhodné ředění vzorků tak, aby na SDS-PAGE bylo naneseno stejné množství proteinů od každého vzorku. Příprava gelu: 1. S použitím rukavic vyčistit skla, promýt pod tekoucí vodou, umýt detergentem, propláchnout vodou, opláchnout ethanolem a utřít. 2. Sestavit skla se spacery a sevřít je svorkami. 3. Připravit roztok pro dolní gel, jemně promíchat a nalít mezi připravená skla asi do 2/3. Převrstvit gel slabou vrstvou destilované vody. Nechat polymerovat 30 minut. 4. Slít horní vrstvu destilované vody, připravit roztok pro horní gel, nalít jej na dolní gel, vsunout hřebínek a nechat polymerizovat 45 minut. Nanášení vzorků a elektroforéza: 1. Skla s gelem umístíme do elektroforetické aparatury, dolijeme elektroforetický pufr a opatrně vytáhneme hřebínky. 2. Na gel nanášíme 10-20 ul vzorku (množství závisí na koncentraci proteinů v buněčných lyzátech). 3. Připojíme aparaturu ke zdroji. Pro průchod horním gelem aplikujeme 80V, poté zvýšíme napětí na 120V. 4. Elektroforézu zastavím v momentě, když hrana barvičky opouští gel. Barvení gelu na proteiny: 1. Gel ponoříme do barvícího roztroku a ponecháme na kývačce 1 hod. 2. Odlijeme barvící roztok a gel zalijeme roztokem odbarvovacím. Odbarvujeme opět na kývačce. Odbarvovací roztok měníme každých 20-30 minut. Po odbarvení gel vysušíme na sušičce gelů. Sestavení blotovací aparatury: 1. Nastříháme 4 kusy papíru Whatman 3MM a nitrocelulózovou membránu stejné velikosti jako je proteinový gel. 2. Navlhčíme papíry Whatman a pórézní podložky v transferovém pufru. 3. Plastikovou svorku umístíme do vaničky s transferovým pufrem černou plochou dolů. Na ní položíme pórezní podložku a vytlačíme bubliny. 4. Na podložku umístíme 2 navlhčené filtrační papíry Whatman a opět vytlačíme bubliny. 5. Na papíry Whatman položíme gel a na něj opatrně navlhčenou nitrocelulózovou membránu. 6. Na membránu pak opět položíme dva papíry Whatman, vytlačíme bubliny a na ně druhou pórézní podložku. Opět vytlačíme bubliny. 7. Takto sestavený sendvič sevřeme do plastikové svorky a umístíme do vaničky s transferovým pufrem a chladítkem. 8. Blotujeme 1 hod při 100 V. Detekce proteinů na membráně pomocí protilátek: 1. Po skončení blotingu promyjeme nitrocelulózovou membránu v 5% roztoku sušeného mléka v TBS-Tween po dobu 30 minut při pokojové teplotě nebo přes noc při 4^ oC. 2. Inkubujeme membránu s primární protilatkou anti-vimentin ředěnou 1:1000 v 5% roztoku sušeného mléka v TBS-Tween 1 hod při pokojové teplotě nebo přes noc při 4^ oC. 3. 3x promyjeme v TBS-Tween (cca 7 minut každé promytí). 4. Inkubujeme membránu 1 hod se sekundární protilátkou s konjugovanou peroxidázou (anti-mouse IgG ředěná 1:10000 v TBS-Tween) při pokojové teplotě. 5. Promyjeme dvakrát TBS-Tween a dvakrát TBS. 6. Opláchneme membránu v destilované vodě, osušíme na ubrousku a umístíme na fólii. 7. Smícháme roztoky A a B z ECL kitu (Amersham) 1:1 a nakapeme na membránu. Inkubujeme 5 minut. 8. Osušíme membránu ubrouskem, přiklopíme folií a ve světlotěsné kazetě odneseme do temné komory. 9. Přiložíme fotografický papír a exponujeme 1 minutu (podle intenzity signálu upravíme délky dalších expozic) 10. Fotografický papír přeneseme do vývojky dokud se neobjeví signál. 11. Krátce opláchneme ve vodě a ponoříme jej na 5 minut do ustalovače. 12. Nakonec film promýváme alespoň 1 hodinu v destilované vodě a vysušíme. Použité roztoky Transferový pufr: TBS: TBS-Tween: 48mM Tris 50 ml 1M Tris-Cl pH=8.0 přidat 1,5 ml Tween 20 do 2 litrů TBS 39mM glycin 57,6 ml 5M NaCl 20% methanol doplnit vodou do 2 litrů Odbarvovací roztok: Tris-glycin elektroforetický pufr (ph=8,3): 500 ml metanolu 25mM Tris 400 ml destilované vody 250mM glycine 100 ml kyseliny octové 0,1% (w/v) SDS Pufr pro alkalickou fosfatázu: Barvící roztok: (barvení proteinů) 1ml 1M Tris-CL, pH=9, 200 ul 5M NaCl 2,5 g Coomassie Blue na 1L odbarvovacího roztoku 50 ul 1M MgCl[2] doplnit destilovanou vodou do 10 ml Dolní (dělící) gel – 10% (10ml) Horní (zaostřovací) gel – 4% (7,5ml) H[2]O 4,9 ml H[2]O 5,62 ml 40% Akrylamid 2,4 ml 40% Akrylamid 0,79 ml 1,5M Tris-Cl (pH=8,8) 2,5 ml 1,5M Tris-Cl (pH=6,8) 0,94 ml 10% SDS 0,1 ml 10% SDS 75 ul Ammonium persulfate 75 ul Ammonium persulfate 30 ul TEMED 7,5 ul TEMED 10 ul 2xCSB lyzační pufr 6,9 ml H[2]O 2 ml glycerol 1,2 ml 1M Tris pH=6,8 0,4 ml 0,2% Bromfenolová modř v 1M Tris pH=6,8 2 ml 20% SDS + před použitím přidat 100 ul beta-merkaptoethanolu k 900 ul 2x CSB Úloha č.2 Detekce změn množství, lokalizace a strukturního uspořádání vimentinu během makrofágové diferenciace monoblastů BM2 pomocí nepřímé imunoflourescence Během makrofágové diferenciace dochází k nárůstu exprese proteinu intermediárních filament – vimentinu. Ten vytváří u makrofágů hustou bohatě rozvinutou síť vláken v cytoplazmě. Nepřímá imunoflourescence: - detekce množství, lokalizace a strukturního uspořádání proteinů ve fixovaných buňkách nebo tkáních - využití specifických primárních protilátek - sekundární protilátky fluorescenčně značené (FITC, rhodamin, texas red…) - fluorescenční molekula po excitaci zářením o určité vlnové délce emituje záření o jiné vlnové délce - fluorescenční mikroskop – excitační filtr (zářeni dopadajíci na preparát) - emisní filtr (filtruje záření vycházející z preparátu) - umožňuje detekci více proteinů naráz (více fluorescenčních molekul) - lze lokalizovat detekovaný protein do buněčných organel značených specifickými sondami Fixační média Fixace je operace, prováděná za účelem zastavení všech procesů, probíhajících v buňce, zachování co možná nejpřesnějšího stavu a struktury tkáně. Fixační činidlo je voleno podle řešeného diagnostického problému, typu a velikosti dostupného materiálu a podle zvolené zalévací a barvicí metody. Roztoky formaldehydu, paraformaldehydu, glutaraldehydu, methanol … Montovací média Pro ochranné účely a následné optimální mikroskopické vyšetření jsou obarvené buňky montovány vhodnými montovacími činidly. Použitý typ závisí na daném protokolu. Jedním z nejdůležitějších parametrů montovacích médií je index lomu (nD); musí být okolo 1,5, čímž odpovídá indexu lomu skla. Glycerol, Mowiol (Calbiochem), Vectashield (Vector), Flouromont-G (Sothern Biotechnology Associates) … Příprava vzorků 1x10^6 buněk BM2 inkubovat s forbolovým esterem TPA (7.5 ng/ml kultivačního media) v 5ml misce s krycím sklíčkem položeným na dno misky. Po 48 hod jsou buňky přisedlé na krycí sklíčko. Zároveň kultivovat stejné množství BM2 buněk jako kontrolu. Po 48 hod kontrolní buňky, které zůstávají v suspenzi, sklidit centrifugací při 400 g/5 min. Buňky opláchnout roztokem PBS a 5x 10^4 buněk cytocentrifugovat na krycí sklíčko 400 g/ 5 minut. Sklíčka s buňkami (kontrolními i po kultivaci s TPA) opláchnout v TBS a fixovat ledovou směsí aceton/metanol (1:1) 10 minut při 4^oC. Po fixaci promýt sklíčka s buňkami 3x 5 minut v TBS a inkubovat 1 hodinu s anti-vimentin primární protilátkou ředěnou 1:100 v TBS-Tween. Sklíčka promýt 3x v TBS-Tween a inkubovat v temnu 1 hodinu se sekundárním protilátkou konjugovanou s FITC ředěnou 1:100 v TBS-Tween. Sklíčka opět promýt – 2x TBS-Tween a 2x TBS. Na závěr inkubovat 5 minut v TBS s roztokem propidium iodidu (10 ug/ml) – barvení jader. Nakonec sklíčka opláchneme destilovanou vodou a montujeme na podloží sklíčka 3 ul Mowiolu (montovací medium od firmy Calbiochem). Preparáty pozorujeme ve fluorescenčním mikroskopu s vhodným emisním a excitačním filtrem pro FITC. Použité protilátky a roztoky: TBS: TBS-Tween: 50 ml 1M Tris-Cl pH=8.0 přidat 1,5 ml Tween 20 do 2 litrů TBS 57,6 ml 5M NaCl doplnit vodou do 2 litrů Fixační směs: Montovací médium: Aceton:metanol 1:1 Mowiol (Calbiochem) Protilátky: myší monoklonální anti-vimentin protilátka (Sigma Aldrich) anti-myší IgG konjugovaná s FITC (Sigma Aldrich) Doplňková úloha – barvení buněčných struktur na živých buňkach – jádra a lysozomy Pro barvení struktur v živých buňkách lze využít flourescenční látky (sondy), které procházejí cytoplazmatickou membránou a následně se hromadí v určitém buněčném kompartmentu. Barvení může být úměrné některé z důležitých vlastností barvených organel (membránový potenciál u mitochondrií, acidifikace lysozomů …). Další alternativou jsou vektory pro expresi fůzních proteinů (protein se specifickou buněčnou lokalizací lokalizací + flourescenční protein). Existují pochopitelně i sondy pro detekci struktur ve fixovaných buňkách. Příklady: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook/tables/Molecular -Probes-organelle-selective-probes.html Jádra – Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYTO Mitochondrie – MitoTracker red, MitoTracker orange, rhodamine 123, JC-1 Lysozomy – akridinová oranž, DND-153, DND-160 Hoechst 33342 – permeabilni, vazba na DNA do AT bohatych oblasti do maleho zlabku, excitace 350 nm, emise 461 nm Akridinová oranž – permeabilní, protonuje se v lysozomech, excitace 503 nm, emise 530 nm 4x10^5 buněk MDA-MB-231 inkubovat v 5ml misce s krycím sklíčkem položeným na dno misky. Po 24 hod jsou buňky přisedlé na krycí sklíčko. Sklíčka s buňkami opláchnout v PBS a inkubovat 5 minut v PBS s akridinovou oranží (5ug/ml) a Hoechst33342 (5 ug/ml). Pozorovat pod flourescenčním mikroskopem. Úloha č.3 Transfekce živočišných buněk elektroporací Úvod: V současné době existuje velké množství metod pro přenos DNA (RNA) do eukaryotických buněk. Obecně je lze rozdělit do 3 kategorií: Přenos fyzikálními metodami: elektroporace, mikroinjekce Přenos pomocí virů Přenos biochemickými metodami: precipitace fosporečnanem vápenatým, využití kationickým lipidových činidel (lipofekce), přenos pomocí DEAE-dextranu Volba použité metody závisí na typu buněk, požadované účinnnosti transfekce a v neposlední řadě také na možnostech laboratoře.Elektroporace se používá pro přechodnou transfekci suspenzních i adherujících buněk a je založena na vystavení buněk krátkému elektrickému šoku, jehož následkem dojde k přechodnému otevření pórů v plazmatické membráně. Těmito póry pronikne DNA do buňky. Při lipofekci dochází nejprve k vytvoření komplexů záporně nabité plazmidové DNA s kationickým lipidovým činidlem. Takto vytvořené komplexy jsou schopny pronikat přes lipidovou membránu do eukaryotických buněk. Cíl: Naučit se základy manipulace se suspenzními buňkami BM2, vytvořit přechodné transfektanty BM2cmv-EGFP metodou elektroporace. Postup- elektroporace: 1. 10^7 exponenciálně rostoucích buněk BM2 centrifugovat 5 min/500g 2. resuspendovat pelet v 400ml média obsahujícím 1,25% DMSO 3. přidat transfekční směs (10 mg cmv-GFP nebo tRNA) 4. nastavit elektroporační parametry U=260V, C=1050 mF, R=2310W 5. provést elektroporaci a okamžitě přenést buněčnou suspenzi do připraveného média obsahujícího 1,25% DMSO 6. 24 hod. po elektroporaci buňky promýt, pozorovat pod fluorescenčním mikroskopem, vyfotit a stanovit účinnost transfekce. Úloha č.4 Stanovení transkripční aktivity receptorů pro kyselinu retinovou (RAR) v buňkách BM2 Úvod: Mezi významné regulátory genové exprese patří transkripční faktory (TF). Jejich hladina a aktivita musí v buňkách podléhat přísné regulaci. Obecně lze říct, že změna v úrovni exprese určitého TF nemusí automaticky znamenat změnu v jeho aktivitě. Ta může být ovlivněna celou řadou faktorů – fosforylací, vazbou aktivátoru či inhibitoru, lokalizací v buňce … Aktivita některých TF koreluje s jejich DNA vazebnou schopností a proto ji lze stanovit pomocí gel shift nebo gel supershift assaye. Obecně lze aktivitu libovolného TF stanovit přechodnou transfekcí reportérového plazmidu a následným měřěním aktivity reportérových genů v buněčných lyzátech. Reportérový plazmid: Plazmid obsahující reportérový gen (nejčastěji luciferázu) pod kontrolou promotoru, jehož aktivita je řízena specifickým TF. V našem případě budeme používat plazmid RAREβ2-TK-LUC, kde genu kódujícímu luciferázu je předřazen minimální promotor s vazebným místem pro RAR. Postup: A) TRANSFEKCE 1. Do mikrozkumavky napipetovat 250ul média OPTI-MEM a přidat 6 ul transfekčního činidla Fugene6. 2. Přidat směs plazmidových DNA sestávající se z 1,5 ug RAREβ2-TK-LUC a 1,5 ug CMV-β-gal a promíchat. 3. Inkubovat 15 minut při pokojové teplotě. 4. Přikapat tuto směs ke 4x10^6 buňkám BM2 ve 2,5 ml kompletního média. Inkubovat v CO[2] inkubátoru do druhého dne. 5. Druhý den buňky rozdělit na dvě 5ml misky, přidat 5 ul 10^-3M kyseliny retinové a inkubovat v CO[2] inkubátoru do druhého dne. 6. Buňky sklidit, opláchnout v PBS a resuspendovat ve 100 ul 0,25M Tris pH 7,5. B) Test na aktivitu β-galaktosidázy 1. Buněčnou suspenzi lyzovat 3 cykly opakovaného zamražování a rozmražování. 2. Po posledním rozmražení centrifugovat buněčný lyzát 5 minut při max. otáčkách v chlazené mikrocentrifuze. 3. Přenést supernatant buněčného lyzátu do nové mikrozkumavky a uchovat v -70°C nebo provést vlastní testy. 4. Pro každý testovaný vzorek na aktivitu β-galaktosidázy připravit následující směs: 100x roztok Mg 4 ml 1x ONPG 88 ml 0,1M fosfátový mix pH 7,5 268 ml 5. Směs rozpipetujte do zkumavek ke 40 ul buněčného lyzátu a inkubujte při 37°C se neobjeví žlutavé zbarvení. 6. Zastavte reakci přidáním 667 ml 1M Na[2]CO[3.] 7. Stanovte optickou densitu měřením při vlnové délce 420 nm. (rozsah linearity je 0,2-0,8 OD). Roztoky: 100x roztok Mg: 0,1M MgCl[2], 4,5M b-merkaptoetanol 1x ONPG: 4 mg/ml o-nitrofenyl-b-D-galaktopyranosidu v 0,1M fosfátovém mixu pH 7,5 0,1M fosfátový mix: 41 ml 0,2M Na[2]HPO[4 ]. 2H[2]O a 9 ml 0,2M NaH[2]PO[4 ]. 2H[2]O + 50 ml H[2]O. C) Test na aktivitu Luciferázy 1. 10 ml lyzátu přenést do 90 ml 0,25M Tris pH 7,5. 2. Přidat 360 ml luciferase assay buffer, přenést do luminometrické kyvety a promíchat na vortexu. 3. Přenést do komůrky luminometru, přidat 200 ml roztoku luciferinu (luciferin stock solution ředěný 5x H[2]O) a zaznamenat údaj o absolutní luciferázové aktivitě na luminometru. 4. Relativní luciferázovou aktivitu každého vzorku stanovit jako podíl absolutní luc. aktivity a b-gal aktivity na 1 ml extraktu. Zásobní roztoky: Luciferase assay buffer: Výsledný roztok Konc. zásobního roztoku Příprava 5ml pracovního roztoku 25mM Gly-Gly pH 7,8 250mM 0,5 ml 15mM KH[2]PO4, pH 7,8 0,1M 750 ml 15mM MgSO[4] 1M 75 ml 4mM EGTA 400mM 50 ml 2mM ATP 100mM 100 ml 1mM DTT 1M 5 ml ddH[2]O - 3 520 ml Luciferine stock solution: 1mM D-luciferin 25mM glycylglycine (Gly-Gly) 10mM DTT Úloha č.5 Stanovení poškození DNA po působení peroxidu vodíku na buňky karcinomu prsu metodou comet assay Úvod: Stanovení genotoxicity látek je důležité při posouzení jejich využití v praxi. V současné době existuje řada metod, které umožňují stanovit genotoxický účinek látek (Amesův test, test na chromozomové aberace, test výměny sesterských chromatid, testování mutaci v genu pro tymidinovou kinázu, stanovení mikrojader …). Jednou z možností testování genotoxických účinků na savčích buňkách je comet assay, který je založen na principu detekce migrace DNA v elektrickém poli. Výhodou této metody je jednoduchost, možnost detekce více typů poškození DNA, možnost testování buněk a tkání z in vivo organismů. Existuje celá řada modifikací tohoto testu, které umožňují detekci určitého typu poškození DNA. Asi nejuniverzálnější metodou je comet assay v alkalických podmínkách, která umožňuje současné stanoveni dvou – a jedno-řetězcových zlomů ale také jiných typů DNA poškození (kroslinků ….). Podstatou této metody je ukotvení jednotlivých buněk v agarozovém gelu, jejich lyze v alkalickém prostředí a následná elektroforéza. Míru poškození DNA lze stanovit následně pomocí počítačového softwaru. V jasných případech rovněž „okometricky“. Postup: a) příprava buněk: 4x10^5 buněk MDA-MB-231 inkubovat v 5ml misce. Druhý den přidat 1 ul 3% peroxidu vodíku. Po 5-10 minutach buňky sklidit, opláchnout PBS a naředit na výslednou koncentraci 20 tis buněk/20 ul PBS. b) příprava skel: Na podložní sklíčko nanést tenkou vrstvu 1% agarózy v PBS a nechat přes noc zaschnout při pokojové teplotě. Druhý den nanést vrstvu 0,5% agarózy v PBS (110 ul), překrýt krycím sklíčkem a nechat zatuhnout v lednici. Smíchat 20 ul směsi buněk v PBS s 90 ul 0,5% LMP agarózy v PBS temperované na 37^OC a nanést na sklíčko, opět překrýt krycím sklíčkem a nechat zatuhnout v lednici. Po zatuhnutí na tuto vrstvu nanést poslední vrstvu 0,5% LMP agarózy, překrýt krycím sklíčkem a nechat zatuhnout lednici. Po zatuhnutí sundat krycí sklíčko a ponořit do lyzačního roztoku. Inkubovat přes 1 hodinu/přes noc. c) elektroforéza a barvení: Opláchnout sklíčka v elektroforetickém pufru a položit je do elektroforetické vany s pufrem na dobu 30 minut. Následně běžet elektroforézu na 20V 30 minut. Sklíčka poté neutralizovat 3 x 5 minut v neutralizačním pufru. Na sklíčka kápnout 50 ul roztoku propidium iodidu (2ug/ml) a překrýt krycím sklíčkem. Po 5 minutách sejmout krycí sklíčko a pozorovat pod flourescenčním mikroskopem. Roztoky: Lyzační roztok: 100 mM EDTA, 2,5 M NaCl, 10 mM Tris pH=10, 1% Triton X-100 Elektroforetický pufr: 1 mM EDTA, 300 mM NaOH, pH > 13 Neutralizační roztok: 0,5 M Tris, pH=7,5