Technologické aspekty čipovýchTechnologické aspekty čipových
technologiítechnologií
Boris Tichý
7.10.2011
LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERLÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSSITYITY
Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN BrnoInterní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno
Centrum molekulární biologie a genové terapieCentrum molekulární biologie a genové terapie
Expresní DNA microarrayExpresní DNA microarray
Čipové technologieČipové technologie
Princip – sondy vázané na nosný podkladPrincip – sondy vázané na nosný podklad
 DNADNA
 Proteinové (proteiny, protilátky)Proteinové (proteiny, protilátky)
 BuněčnéBuněčné
 TkáňovéTkáňové
 Chemické látky (malé chemické látky, karbohydráty –Chemické látky (malé chemické látky, karbohydráty –
glycoarrays)glycoarrays)
DNA microarraysDNA microarrays
Různé dělení podle…Různé dělení podle…

Typu sondTypu sond

Velikosti a hustotyVelikosti a hustoty

Technologie výrobyTechnologie výroby

ZnačeníZnačení

AplikaceAplikace

Atd.Atd.
Nosný podkladNosný podklad
 SkloSklo
 mikroskopické sklíčko (25 x 75 mm)mikroskopické sklíčko (25 x 75 mm)
 speciální formátyspeciální formáty
 různé úpravy povrchurůzné úpravy povrchu – aminosilan, epoxy atd.– aminosilan, epoxy atd.
 Nylonová nebo nitrocelulózová membránaNylonová nebo nitrocelulózová membrána
 Plast, gelPlast, gel
 MikrokuličkyMikrokuličky
 BeadArraysBeadArrays®® (Illumina)(Illumina)
 xMAP (Luminex)xMAP (Luminex)
Technologie přípravyTechnologie přípravy
 in-situin-situ syntéza sondsyntéza sond
 fotolitografiefotolitografie
 masky (Affymetrix)masky (Affymetrix)
 mikrozrcátka (Roche/NimbleGen, febit)mikrozrcátka (Roche/NimbleGen, febit)
 „„ink-jet“ink-jet“ (Agilent)(Agilent)
 elektrochemieelektrochemie (Combimatrix(Combimatrix ))
 deponování sonddeponování sond
 kontaktní -kontaktní - jehlyjehly
 bezkontaktníbezkontaktní
 mikrokuličkymikrokuličky
FotolitografieFotolitografie
““Ink-jet” syntézaInk-jet” syntéza
Spotování (tisk)Spotování (tisk)
Typy DNA sondTypy DNA sond
 BACBAC (bacterial artificial chromosome),(bacterial artificial chromosome), PACPAC (P1-derived AC)(P1-derived AC)
 cDNAcDNA
 oligonukleotidyoligonukleotidy
 krátké (~ 25 mery)krátké (~ 25 mery)
 dlouhé (~ 60 mery)dlouhé (~ 60 mery)
 LNA („locked nucleic acid“)LNA („locked nucleic acid“)
Značení vzorkůZnačení vzorků

fluorescencefluorescence

jednokanálovéjednokanálové

vícekanálovévícekanálové

autoradiografieautoradiografie

chemiluminiscencechemiluminiscence

kolorimetriekolorimetrie
AplikaceAplikace

ExpreseExprese

mRNAmRNA

microRNAmicroRNA

GenotypizaceGenotypizace

SNP arraySNP array

APEXAPEX

Resequencing arrayResequencing array
AplikaceAplikace

Genomové aberaceGenomové aberace

ArrayCGHArrayCGH

Tiling arraysTiling arrays

EpigenetikaEpigenetika

Tiling arraysTiling arrays

ArrayCGHArrayCGH

SNP arraySNP array
Zpracování vzorků - izolaceZpracování vzorků - izolace
RNARNA
fenol-chloroform – Trizolfenol-chloroform – Trizol
kolonkakolonka
poly-Apoly-A
microRNAmicroRNA
DNADNA
FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded)FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded)
Zpracování vzorků - QCZpracování vzorků - QC
RNARNA
elektroforézaelektroforéza
BioAnalyzerBioAnalyzer
RT-PCR – 3‘ a 5‘ fragmentRT-PCR – 3‘ a 5‘ fragment
DNADNA
elektroforézaelektroforéza
Zpracování vzorků - amplifikaceZpracování vzorků - amplifikace
RNARNA
in-vitro transkripce („Eberwine“)in-vitro transkripce („Eberwine“)
jedno i vícekolovájedno i vícekolová
T7 (T3, SP6) RNA polymerázaT7 (T3, SP6) RNA polymeráza
oligo-dT primer s promotorem RNA polymerázyoligo-dT primer s promotorem RNA polymerázy
dvouvláknová cDNA !dvouvláknová cDNA !
další metodydalší metody
PCR-based (template switching PCR, random PCR,PCR-based (template switching PCR, random PCR, 3'3'
tailing with 5' adaptor ligation PCRtailing with 5' adaptor ligation PCR))
Ribo-SPIARibo-SPIA
DNADNA
whole genome amplification (WGA)whole genome amplification (WGA)
PCR-basedPCR-based
isotermálníisotermální
Amplifikace signáluAmplifikace signálu
dendrimerydendrimery
streptavidin + anti-streptavidin Ab značenéstreptavidin + anti-streptavidin Ab značené
biotinem + fluorescenčně značený streptavidinbiotinem + fluorescenčně značený streptavidin
Značení vzorkůZnačení vzorků
 inkorporace značených nukleotidů (vč.inkorporace značených nukleotidů (vč.
systému streptavidin-biotin)systému streptavidin-biotin)
 inkorporace modifikovaných (aminoallyl)inkorporace modifikovaných (aminoallyl)
nukleotidů + vazba barvynukleotidů + vazba barvy
 ne-enzymatická reakce vazby nane-enzymatická reakce vazby na
nemodifikované vzorky (ULS – universalnemodifikované vzorky (ULS – universal
linker system)linker system)
 dendrimerydendrimery
 ligace značených oligonukleotidů,ligace značených oligonukleotidů,
prodlužování řetězce značenými nukleotidyprodlužování řetězce značenými nukleotidy
Hybridizace a odmýváníHybridizace a odmývání
fragmentace vzorkůfragmentace vzorků
enzymatickáenzymatická
ne-enzymatickáne-enzymatická
hybridizacehybridizace
teplotateplota
časčas
objemobjem
složení pufrusložení pufru
odmýváníodmývání
teplotateplota
časčas
složení pufrůsložení pufrů
Hybridizace a odmýváníHybridizace a odmývání
SkenováníSkenování
alfaimager, chemiluminiscenční skeneryalfaimager, chemiluminiscenční skenery
fluorescenčnífluorescenční
rychlostrychlost
rozlišenírozlišení
počet kanálůpočet kanálů
typ detektorutyp detektoru
autofokus, extended depth (16bit -> 20bit)autofokus, extended depth (16bit -> 20bit)
Illumina BeadArray

Sondy vázané na mikrokuličkáchSondy vázané na mikrokuličkách

Sučástí každé sondy je tzv. barcodeSučástí každé sondy je tzv. barcode

Směs kuliček s různými sondami je nanesena naSměs kuliček s různými sondami je nanesena na
sklíčko s jamkamisklíčko s jamkami

Dekódování pomocí hybridizace s barcodyDekódování pomocí hybridizace s barcody

Každý čip unikátKaždý čip unikát
xMAPxMAP
Sondy vázané na kuličkáchSondy vázané na kuličkách
Kuličky kódovány pomocí dvouKuličky kódovány pomocí dvou
fluoroforů (až 500 kombinací)fluoroforů (až 500 kombinací)
Detekce průtokovou cytometrií (kuličkaDetekce průtokovou cytometrií (kulička
– červený laser, analyt – zelený laser)– červený laser, analyt – zelený laser)
Expresní DNA microarrayExpresní DNA microarray
LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERLÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSSITYITY
Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN BrnoInterní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno
Centrum molekulární biologie a genové terapieCentrum molekulární biologie a genové terapie
HistorieHistorie
1987 Kulesh et al. - cDNA knihovna na papírovém filtru1987 Kulesh et al. - cDNA knihovna na papírovém filtru
Přelom 80./90. - E. Southern – in-situ syntézaPřelom 80./90. - E. Southern – in-situ syntéza
oligonukleotidůoligonukleotidů
1991 – Fodor et al. - světlem řízená paralelní syntéza1991 – Fodor et al. - světlem řízená paralelní syntéza
1995 – Schena et al. - cDNA expresní microarray1995 – Schena et al. - cDNA expresní microarray
1996 – lidská cDNA microarray1996 – lidská cDNA microarray
1997 – celogenomová (kvasinka)1997 – celogenomová (kvasinka)
cDNA microarraycDNA microarray
1997 – celogenomová (kvasinka)1997 – celogenomová (kvasinka)
oligonukleotidová microarrayoligonukleotidová microarray
TypyTypy
High- i low- densityHigh- i low- density
Sondy – krátké i dlouhé oligonukleotidy, cDNASondy – krátké i dlouhé oligonukleotidy, cDNA
Sklíčka, cartridge, mikrokuličky, membránySklíčka, cartridge, mikrokuličky, membrány
Jedno- a dvou- kanálovéJedno- a dvou- kanálové
AplikaceAplikace
mRNAmRNA
– CelogenomovéCelogenomové
– Exonové (whole transcript)Exonové (whole transcript)
– Cílené – konkrétní dráhy, diagnózyCílené – konkrétní dráhy, diagnózy
microRNAmicroRNA
lincRNA (long intergenic noncoding RNA)lincRNA (long intergenic noncoding RNA)
AplikaceAplikace
Studium efektů stimulů na genovou expresiStudium efektů stimulů na genovou expresi
– Chemikálie (např. léčiva)Chemikálie (např. léčiva)
– Fyzikální faktory (záření)Fyzikální faktory (záření)
– Gene knock-out (siRNA)Gene knock-out (siRNA)
– Gene transfection (např. transkripčníGene transfection (např. transkripční
faktory, mutantní alely)faktory, mutantní alely)
Studium rozdílů mezi vzorkyStudium rozdílů mezi vzorky
– Tkáně a orgányTkáně a orgány
– DiagnózyDiagnózy
RNARNA
PřepisPřepis
– Oligo-dT primingOligo-dT priming
• Kvalitní RNAKvalitní RNA
• 3' biased sondy3' biased sondy
– Random priming – hexa, okta, nona meryRandom priming – hexa, okta, nona mery
• I degradovaná RNAI degradovaná RNA
• Celý transkriptCelý transkript
RNARNA
QC
elektroforéza – 18S a 28S rRNA (1 : 2-3)
BioAnalyzer
RT-PCR – 3‘ a 5‘ fragment
O K , c o m p a c t R N A D e g r a d a d e d R N AO K , c o m p a c t R N A D e g r a d a d e d R N A
Affymetrix GeneChipAffymetrix GeneChip
Krátké oligonukleotidy – 25meryKrátké oligonukleotidy – 25mery
=> vysoká míra nespecifické hybridizace=> vysoká míra nespecifické hybridizace
=> probe-set – několik sond pro každý gen (~11)=> probe-set – několik sond pro každý gen (~11)
=> perfect match a mismatch sondy (rozdíl ve 13.=> perfect match a mismatch sondy (rozdíl ve 13.
nukleotidu) – odhad nespecifické hybridizacenukleotidu) – odhad nespecifické hybridizace
=> speciální metody pro zpracování dat=> speciální metody pro zpracování dat