Fyziologie kmenových buněk Proliferation & Differentiation Se If-renewal Jiří Pacherník E-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223/116 Podpořeno FRVŠ 540/2007 KMENOVÉ BUŇKY - zdroj buněk dané tkáně / orgánu - primární buňky pro danou strukturu Schopnost - dávat vznik dalším typům buněk (schopnost diferencovat) - sebeobnovy (selfrenewal) = > kmenovost (stemness) Dělení buněk a jejich sebeobnova DbJbíjj buněk (proJiferacs) Symetricky - vznikají dvě identické buňky (^) ® Asymetricky - jedna si zachovává původní fenotyp, druhá je již jiná Diferenciační dělení obě nově vzniklé buňky mají i nový fenotym, jsou dalším stupněm v dané diferenciační lin diferenciační dělením symetrické diferenciační dělením asymetrické DVíBfBíiďm^B {fp-zfíi-zňuvíiin) buněk Buňky mění svůj fenotyp v na základě změny exprese svého genotypu v důsledku vnějších signálů. Regulace diferenciace je často provázána s proliferací (epigenetické změny v jádře během mitotického cyklu?). Pluripotent Stem Cells (^Totipotent 3 In vivo fertilized egg S cell embryo Cultured undifferentiated stem cells Neural cells Cardiac muscle Blood cells Kmenová buňka aktuální <-> potencionální Přechodně/transientně se dělící buňky (Progenitory)* Terminálne diferencovaná buňka** * Často proliferují a mají schopnost krátkodobé sebeobnovy. 7£ maturace ** Post-mitotické buňky = už se nikdy nedělí. Ne všechny terminálne diferencované buňky jsou post-mitotické. přestavba genomu / chromatinu -> exprese jiného paternu genů -> jiná morfologie, jiné funkce a potenciál Determinace - předurčení pro danou diferenciační linii / dráhu geny a jejich produkty - „houskeeping" (metabolismus, transkripce / translace, základy cytoskeletu) - všeobecně abundantní (transripce/translace, cytoskelet, komponenty signálních drah) - specifické (enzymy, specifické transkripční faktory, cytoskelet - komponenty intermediálních filament, s cytoskeletem asociované proteiny) A hadiska ^Snovnosú ivom daJší burjščrjé ivpy se buňky dáJÍ mi; Totipotentní - mohou z nich vznikat všechny buňky daného živočišného druhu Pluripotentní - mohou dát vznik všem buňkám budoucího jedince (všechny tři zárodečné listy) Multipotentní - může z nich vznikat větší počet buněčných typů dané buněčné řady (Oligopotentní - podobné jako multipotentní, ale méně typů) Unipotentní - dávají vznik jen dvěma typům buněk Nullipotentní - mohou se pouze dělit, nemění fenotyp TaiipaianiJTJj buňky -1- až 8-buněčné embryo (= Embryonální nespecifikované - pouze savci) - Omezené možnosti dělení (neprobíhá transkripce; myš 2/4 b., člověk 8 b.) - Existují pouze přechodně 2-cell stage Ztráta totipotence v průběhu časné embryogenéze - vznik nerovnoměrných podmínek pro růst buněk - tento proces je ireverzibilní The Enjphutolast will becomť part oŕ ihc pľace ni lI. http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/Chap13/Chapter_13.html#fertilization Dělení buněk 2-buněčného embrya, určení polarity a její vliv na další osud blastomer Magdalena Zernicka-Goetz 2006 ME EM MM 4 EE * RANDOM 80% of all embryos M - meridiální / E - ekvatoriální Orientace blastomer 4-buněčného embrya a její vliv na zachování absolutní totipotence těchto buněk "ME" EMBRYO still permits CHIMERA OF A/V CELLS MERIDIONAL CHIMERA MA LV VEGETAL) regulative development CHIMERA A OR V CELLS ARREST AT PERI- DI IT --> IMFLANTATION --> Píotyowihx^hlííiche-elralí, Development2005 P\íiňpuí3nhn buňky (savci) a) In vivo: buňky vnitřní buněčné masy buňky epiblastu / primitivního ektodermu buňky nerální lišty (4tý zárodečný list) kmenové buňky teratomů (?) ! (somatické kmenové buňky?) b) In vitro: embryonální kmenové buňky embryonální zárodečné buňky embryonální nádorové buňky (kmenové buňky teratomů) ! (somatické kmenové buňky?) Morula Blastocyst Late blastocyst Egg cylinder Gastrula Ectoplacontai cone Visceral endoderm ectoderm Boiani & Scholer 2005 Kmenové buňky mohou být pluripotentní, multipotentní,... ale pluripotentní nebo multipotentní buňky nemusí být kmenové. Pleopotence (změna v determinaci) pluripotentní buňka \ multipotentní tkáňově specifická buňka Pleopotence / \ i progenitory 1 I multipotentní tkáňově specifická buňka o ^-^(Pleopotentní buňka) terminálne diferencované buňky Schopnost sebeobnovy = self-renewal Schopnost dávat vznik jiným typům buněk = pluripotence / m u Itipotence /..... = > kmenovost = stemness - Společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami, nezralý fenotyp / relativně nediferencované (= dlouhé telomery / vysoká aktivita telomeráz, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,...) = VYHRAZENÉ (PROFESIONÁLNÍ) KMENOVÉ BUŇKY - Některé somatické, terminálne diferencované buňky si zachovávají schopnost sebeobnovy a v případě potřeby i multipotence, normálnejšou ale quiescentní (spící) = FAKULTATIVNÍ KMENOVÉ BUŇKY (snad některé hepatocyty a buňky plicních epitelů) - Některé diferencované buňky si také dlouhodobě zachovávají schopnost proliferace, sebeobnovování a podílejí se tak na udržení homeostáze v tkáni = Sebeobnovující se diferencované buňky - dávají vznik buňkám dané buněčné struktury / tkáně / orgánu / (organismu) - relativně pomalá proliferace - jsou nejčastěji multipotentní, snad některé i pluripotentní či unipotentní - jsou základním zdrojem buněk pro regeneraci organismu a homeostázi - mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = in vivo asymetrické dělení - s věkem jich ubývá, ale pravděpodobně nikdy během života jedince úplně nevymizí profesionálni SC - v tkáni jsou lokalizovány ve specifické oblasti, „niche" (koutek) - mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,... - ??? Somatické kmenové buňky (embryonální a adultní) Buňky některých zárodečných linií (neurální lišta, primordiální zárodečné buňky) a kmenové buňky trofoblastu KMENOVÉ BUŇKY ODVOZENÉ/SEKUNDÁRNÍ = existují jen „in vitro1 jsou připravené z populací pluripotentních embryonálních buněk, ze zárodečných buněk, nebo z progenitorů embryonálních a dospělých tkání relativně rychle proliferují některé jsou multipotentní (z embryonálních a dospělých tkání), některé pluripotentní (embryonální původ) mohou být zdrojem buněk pro regeneraci organismu mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = „asymetrické/symetrické" dělení mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,... ??? Embryonální kmenové buňky -> odvozené z vnitřní buněčné masy (Kmenové buňky epiblastu) Embryonální zárodečné buňky ■> odvozené z primordiálních zárodečných buněk Embryonální nádorové buňky -> odvozené z kmenových buněk teratomů Somatické kmenové buňky odvozené -> odvozené ze somatických kmenových buněk REGULACE KMENOVÝCH BUNĚK Existence kmenových buněk je regulována a) vnitřními (intrinsic) faktory (vývojově specifické transkripční faktory a specifické kombinace drah transdukce signálů) b) vnějšími (extrinsic) faktory (v niche) Kmenové buňky mohou existovat jen v příslušném „NICHE" Co v NICHE najdeme? růstové faktory, proteiny extracelulární matrix, povrchy buněk / buněčný kontakt, hypoxie, nedostatek živin? Podobně jako se zdají být SSCs tkáňově/orgánově specifické, jsou specifické i jejich „niche". NICHE Naveiras, 2006 b. Mouse bone marrow Cap celí » Osteoblast —f — ~Th -------NICHES------------!L)_-_-_!_- Myofibroblast J Astrocyte ^ & ô c. Moose small intestine d. /Mouse sjbventricular and subgrarutar zone a C. elegans (one-cell stage] b £>. meianogaster (neuroblast) Apical G MC _ PAR- 3/PA R- 6/ P KC- 3 PAR-2, PAR-1 — LIN-5/Ga ■ ■ ■ GPR-1/2 • PIE-1 — Microtubules DNA - PARS/PARů/aP KC - Mud/Pi ns-Loco/G,,, - Mira. Pon Brat. Numb. Prospero - Microtubules DMA c D- metanogaster (SOP) Anterior Posterior pi lb \^ pHa — PAR3/PAR6/aPKC — Mud/Pins-Loco/Grri — Pon O \ui b. Nejrdl ..wj 4% Recycling endosome — Microtubules «3> DNA Apical Basal Polarity-Apical Příklady mechanismů regulujících symetrii buněčného dělení na modelových orgaismech NB - neuroblast SOP - sensory organ progenitor (Jan & Jan 2000; Robert Andrews & Julie Ahringer 2007) Planar Polarity Apical Q^J N B hrj GMC Post. Ant. Basal NB Basal SOP Polarized Gpithelium Delaminating neuroblast Metaphase neuroblast Bazooka Inscuteable Pins Numb/Prospero Úloha (trimerických) G-proteinů v regulaci polohy dělícího vřeténka Horizontální orientace vřeténka Náhodná orientace mitotického vřeténka u buněk s inhfoovanými Gpy Symetricky dělící se buňka Asymetricky dělící se buňka Symetricky dělící se buňka ™ Pocfoet laterální polarity Proteiny určující neurální osud buňky Gpy v komplexu s Got W Volný Gpy íf Inaktivovaný volný Gf3y jsaj 2005 Signální dráha LIF (leukémii inhibující faktor) -> gp130 signalling _^»self-renewal _ Evolučně se zdá, že tato dráha hraje důležitou úlohu v regulaci pluripotentních a snad i multipotentních buněk u živočichů obecně (prokázáno i u Drosophilý) Význam gp130 signalizace v průběhu embryogenéze Signální dráha FGFs (Fibroblastové růstové faktory) Signální dráha TGFp / BMPs (Transformující růstový (growth) faktor (3 kostní (bone) morfogenetické proteiny) Type 1 Type II ►CR"Smad)v Smad4 Cytoplasm l-Smad Smad4 Nucleus 1 CROSSTALK FGF & TGF0 DRÁHY TRANSDUKCE SIGNÁLU Potlačení sérového BMP přidaným FGF-2 => inhibice diferenciace hES FGF, IGF EGF, HGF > Ras >MEK1 MH1 1 inker Srn ad 1 i Erk1,2 Other kinases BMP receptor MH2 W ¥ ® MH1 Smad2 NucJear import Epidermal d Mesoderm ventralization fferentiation Massague, 2003 TGFß, Nodal. Activin receptors MHZ (B Nuclear import Mesoderm induction 98 Signální dráha Hedgehog sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh) Ptc - Patched Smo - Smoothened DSL Signální dráha Notch b) genes - a) klasická dráha signální transdukce Notch, po navázání Ugandu (DSL rodina = Delta, Serrate, Lag-2; Jagged) dojde k odštěpení extracelulární části receptoru a následně i intracelulární (NICD - Notch intacellular domain), ta translokuje do jádra a v dimeru s CSL (= CBF1 - Cp binding factor 1) aktivuje transkripci. b) dráha snad aktivovaná dosud neznámým faktorem, kdy dochází k aktivaci proteinu Deltax, který pak inhibuje JNK a CBP/p300 aktivitu. Kadheriny sprostredkovaná komunikace mezi buňkami Phosphorylation sites site Calcium-bimJing site Cíli riHTiibranc -1 í f 11 i 11 - Integriny zprostředkovaná transdukce signálu Ir (>•'_]( r Signální dráha jaderných receptoru obecně cell membráne Boghog 2; Wikipedia Signální dráha jaderných receptoru and ® ( N R ) jaderné (nuclear) receptory transkripční faktory TF TF ( N R I N R ) transkripce transkripce DNA\ sebeobnova x diferenciace ?differenciace x sebeobnova? HYPOXIE GROWTH FACTOR * CYTOKINES (PDOF. TOF0, ILIMNFö. il5,il8.il1u| 5UFPRE5-"SOH GENES ONCOGENES (rtiL Hai.(i1tJ l(nas, r*1, he HERZerbB -ftHtflJ [VEGF [ HEO*HQIQQEME3IB PERITUHOH^L INFLAMMATORY HE*CTIC*t ^ TUMOR SLCOD FLOW AMAEROBtC In this figure the structural and functional effects of Hypoxia, HIF-1 and VEGF on tumor microcirculation, cancer metabolism and therapies are illustrated. The vicious circles that occur are also shown. (Modified with permission from: Baronzio et al. Anticancer Res 1994; 14:1145-1154.) I PCM 4 NUTRIENTS I DRUGS £ «WJKCELLEI MNCiNTnATlON *. FtAMG RESISTANCE ILO0P ST,i3*sH UT!i;Crai|T*HJB.LLÖD CELLS AÜMEQ^TlOH HYPOXIE <& HIF (hypoxií indukovaný faktor) a Normoxia Cell proliferation and survival HIF-1a regulation by proline hydroxylation Expert Reviews in Molecular Medicine 2005 Published by Cambridge University Press HYPEROXIE x NORMOXIE x HYPOXIE x ANOXIE anoxie - 0% kyslíku tkáňová hypoxie - 0-3% kyslíku tkáňová normoxie - 3-5% kyslíku atmosféra - 21% kyslíku In the human organisms, 02 concentration varies significantly between the tissues: in the lung parenchyma and in circulation (McKinley and Butler, 1999; Saltzman et al., 2003; Johnson et al., 2005; Wild et al., 2005), as well as in well irrigated parenchymal organs (liver, kidneys, heart; Wo" Ifle and Jungermann, 1985; Jungermann and Kietzmann, 1997; Roy et al., 2000; Welch et al., 2001; Mik et al., 2004) it is comprised between 14% and 4%. In other tissues, relatively less irrigated, 02 concentration is even lower: in the brain, it varies from 0.5% to 7% (Whalen et al., 1970; Nwaigwe et al., 2000; Hemphill et al., 2005) in the eye (retina, corpus vitreous), from 1 to 5% (Buerk et al., 1993; reviewed in Yu and Cringle, 2005), in the bone marrow, from 0% to 4% (Tondevold et al., 1979; Chow et al., 2000).