M ETAP LAS IE (- TRANSDIFERENCIACE?!) metaplasie - přeměna kmenové nebo progenitorové buňky jednoho typu tkáně v progenitor tkáně jiné transdiferenciace - přeměna buňky jednoho typu na buňku typu jiného bez průchodu buněčným cyklem transdeterminace - metaplasie v průběhu embryogenéze Rawlins & Hogan (2006) Development 133, 2455-2465 Potenciální možnosti: 1) Přímá přeměna fenotypu buňky jednoho typu v buňku typu jiného - s proliferací (metaplasie) - bez proliferace (pravá transdiferenciace) 2) Prvně směrem zpět v diferenciační řadě a následně diferenciace do jiné diferenciační řady (rediferenciace a následně diferenciace). Za pozorované jevy zřejmě ale odpovídají zbytkové populace progenitorů. - s proliferací - bez proliferace (silně nepravděpodobné) Přístupy: a) Vnějšími faktory b) Exogénni expresí vhodných genů c) Přeprogramováním jádra cytoplasmou jiné buňky (sem patří i terapeutické klonování) d) Kombinací výše zmíněných postupů - změny v metylaci DNA / mety lačním paternu (CpG a CpA oblasti) tyto modifikace jsou relativně obtížně změnitelné - změny v metylaci / acetylaci / fosforylaci histonů - telomery / telomerázy - změny v PcG proteinech => transkripce jiných genů = jiný fenotyp A. vnějšími faktory - málá a často sporná účinnost - závislé na buněčném typu, často jen u SCs a TA buněk - pokud je to možné, tak se většinou jedná o malou změnu / krok (lnění úplně jasné, jestli je potřeba rediferenciace!) - uplatnitelnost in vitro spíše s některou z dalších metod a zejména pro zachování získaného fenotypu re- / transdeterminovaných buněk Příklady: - exokrinní buňky pankreatu -> hepatocyty - epitel hltanu -> střevní epitel (po poškození žaludečními kyselinami, tzv. Barrettova metaplasie) - progenitory glií ??? - pigmentové buňky oka (iris) -> buňky rohovky (u čolka) - některé kultivační experimenty ukazují, že různé progentory / SCs mohou nabývat fenotypu jiné diferenciační řady, např SCs / TA epidermis x nervová tkáň - B-lymfocyty mohou tvořit makrofágy Pleopotence* x reprogramování (změna v determinaci) multipotentní terminálne diferencované buňky B. exogénni exprese vhodných genů - výrazně účinější než působení vnějších faktorů - „vhodné" geny jsou zejména cytoplasmatické pro-onkogeny / onkogeny a transkripční faktory - epigenetická paměť buněk (zejména metylace DNA), ale nedovoluje úplnou změnu, je potřeba několikateré dělení buněk, pokud je daná změna vůbec možná, vlastní fenotyp se ale mění velice rychle Příklady: - nadbytečná exprese Ras a c-Myc indukuje částečnou rediferenciaci a transformaci - exprese Pdx1 (marker (3-buněk pankreatu) navozuje částečný fenotyp (3-buněk u hepatocytu a střevních epiteliálních buněk - exogení exprese c-Myc, Klf4, Oct4 a Sox2 navozuje fenotyp ESCs => ÍPSCs u embryonálních fibroblastů (myš), ale i další buňky - transdeterminace Paxa Hoxgeny (např. Pax-6 a oči) iPS bunky - indukovane pluripotentni bunky (Hochedlinger & Plath 2009) Developmental potential Totipotent Zygote Pluripotent ICM/ES cells, EG cells EC cells, mGS cells iPS cells Multipotent Adult stem cells (partially reprogrammed cells?) Unipotent Differentiated cell types Epigenetic status Global DNA demethylation Only active X chromosomes; Global repression of differentiation genes by Polycomb proteins; Promoter hypomethylation X inactivation; Repression of lineage-specific genes by Polycomb proteins; Promoter hypermethylation X inactivation; Derepression of Polycomb silenced lineage genes; !,;Promoter hypermethylation Preimplantation embryo Primitive endoderm +Gatä"4/~ '™1E,S "+Cdx" (IPS) Trophectoderm +Oct4 +Sox2 +Klf4 (+cMyc) / +Myod Fibroblasts — — Muscle / Progenitors Blood progenitors H ^ -PaxS / +Cebpa B cells — — Macrophages Acinar cell — — ^ pcell +Pdx1, Ngn3. Mafa Mature cells Key ^^^^^^ Normal differentiation — — ^ Transcription factor-induced reprogramm ing +/- Factor Ectopic expression/deletion of transcription factor Klf4 Somatic cells Somatic markers silenced Activation of SSEA1 Intermediate cells (transient population) ■ Silencing of retroviral transgenes ■ Activation of pluripotency genes • Activation of telomerase ■ Reactivation of silent X chromosome in female cells ■ Teratomas and germ line chimeras iPS cells • Knockdown of lineage genes ■ Inhibition of DIM A methylation Partially reprogrammed cells (stable cell lines) • Viral transgenes on • Proliferation genes activated • Pluripotency genes silent • Aberrant expression of lineage genes • Teratomas, but no adult chimeras Endogenní transkripční faktory daný/puvodní fenotyp buňky Exogenní(ektopické) transkripční faktory UDÍ. 0> požadovaný fenotyp buňky V Endogenně regulovaný výsledný fenotyp buňky Exogénne dodané transkripční faktory nebývají dostatečně pevně fixovány v genomu - požkození genomu (vlastní vnesení exogénni informace) - destabilizace fenotypu, částečné reprogramování, reverze fenotypu, nežádoucí transformace C. Přeprogramováním jádra cytoplasmou jiné buňky Somatic call nuclear transfer jr% Sen-renewal Enucleation Errtbfy&id body Adull Oocyte Nuclear Iranslc* ! i>riii>ki-.:i ES cell Taralcma V , a- CliliitBia DEMETHYLATTD expression Fusion or stem cells and somatic cella Seli-ronownf Embrroid nbryoi- bodv A říhli liůíoMasT Teraloma Chimera? Hybrid E£ cell DE METHYLATED 1-1 expression Sslf-fanawal? Retroviral lr.miidnrlimi CI rn Ljt y o 111 r: (3,-nr:i into llůroblaíts j Embryonic or admit ritwowast Émbcyold body Teraloma Cllimera? expression PARTIALLY DEMETHYl.ATCD závislost na momentálním stavu buňky velice účinné, ale přenos jádra málo úspěšný u savců fůze buněk je ale relativně běžná buněčná fůze - spojení cytoplasmy a jader dvou buněk za vzniku buňky jediné heterokaryon - produkt fůze buněk jasně odlišitelnými dvěma nebo i více jádry hybridní buňka - vznikne když heterokaryon projde mitózou za vzniku buňky s jedním jádrem ale s více jak 2n DNA (nemusí obsahovat kompletní jadernou DNA původních buněk) Úplné reprogramování terminálne diferencované buňky cytoplasmou oocytu u žab (ale i savci). BMSSCs exprimující p-galaktosidásu pod kontrolou svalově specifického promotoru Heterokaryon Purkiňova neuronu v mozečku a GFP+-BMSSC Regenerace samicích Fah -/-letálních jater (FAH - fumarylaceto-acetate hydroláza) transplantací samčích HSCs Detekce Y chromozomu v játrech po transplantaci (dole) a FAH aktivity vpravo nahoře. Reprogramování jádra, metylace DNA a chyby v embryogenezi 1Í0 100 I ** "5, E W ■i: JO 1 Demetylace otcovského, a reprográmovaného (jaderný přenos) genomu / s y Blastocyst type n Oct4 m RNA n (%) ICM restricted ICM and TE not detected. Cumulus cell clone 53d 18 [340)" 29(54.7)" 6 [11.3]" IVF 30 23 [ISjf 4(13.3)b 3 [10f ICSI 80 60 [75,0 )b 9(lL3)b 11 [13J8]fl'b In vivo fertilized 75 70 [93,3,)c 3 (4.0 )b 2 [2,7]^ Analýza exprese Oct4 mRNA u klonovaných a kontrolních blastocyst (in situ hybridizace). GFP/blaslucysL uviti strong Účinek reprogramování jádra diferencované buňky na expresi Oct4-GFP a schopnost růstu ICM. Vývoj klonů a IVF/ICSI embryí exprimujících GFP in vit r o. blastocysts GFP f OlHjJJDWtll .>•'■.■ >■•■ ilrvTtg ■ % ES n % 15 17 4 31 13 4B 2 SO - S 61 M 0 - 4 31 1 50 - 1 i ES % ES 18 II 1 Q 10 9 0 91 cíli snuare fcrl - 17,86; pO 001 Nucleus donor Ueconstructed oocytes n Two-ceil Morulac [TĚ. of 2 os1h| fila&tocysts n [X of 2 cella] CH1 f luorcsccnt blastocysts n \.%\ Replicates n Wild-type nuclei Cumulus ľcII Qcí4-GFF nuclei C liji u Ilií ľcII CIíTľTJ Cell ivi k:si hi,-,-, 603 J-.'J,- I l ív VO Ml 1 1935 [77^ -.i >"J %3 1 6ĚS{7Af .Vi .Vi o| S6 85 10" I,,-. ■.' 1 27E [BeC" 45QÍ74|E 44rj[SS|b NA 135[S2|l 272 [PSp1 4B5[99|b 3Í>S [90|c K) .V> I -■ 12 L S ]VFf in vitro fertilized; DCS], intracytoplasmic spenn injection; CFL1. Clrcen Fluorescent J]notcin: NA, not applicable. Comparison of proportions it) based on Student ; test itwo tails); superscripts a-d indicate significant difference in < 0.0s) between tbc vliInes within the sa;nc column. ""Inseminated. 'Survived sperm injection.