2. DNA sondy Definice, značení sond a detekce DNA sonda •je sonda hybridisační (hybridisation probe, probe) •Definice:Radioaktivně nebo neradioaktivně značená sekvence nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) používaná k vyhledávání nukleové kyseliny s komplementární sekvencí Sonda chemická •Látka vázající se specificky na určité báze nebo na určité lokální struktury v nukleových kyselinách (např. OsO4, glyoxal, chloracetylaldehyd, diethylpyrokarbonát, hydroxylamin) DNA sonda pro průkaz entorotoxigenní E. coli • •připravená z bakteriální DNA •představovala první praktickou aplikaci technologie rekombinantní DNA (hybridizace kolonií) •Při průkazu infekčního agens v klinickém materiálu •(Moseley et al. J. Infect. Dis. 142, 892-898, 1980) Příklady komerčně dostupných sond •Obr. Hybridizace nukleových kyselin •Proces vytváření dvouřetězcových molekul z jednořetězců DNA nebo RNA •Za předpokladu, že se jejich sekvence vyznačují úplnou nebo částečnou komplementaritou bazí •(na rozdíl od renaturace nedochází ke spojování jednořetězců, které původně byly součástí téže molekuly) • Denaturace a renaturace/hybridisace DNA •Obr. Stringence (těsnost, přísnost) hybridizace •Má vztah k počtu nekomplementárních bazí, které mohou být během opětného vzniku dvoušroubovice tolerovány •Je ovlivňována prostředím, v němž probíhá hybridizace • Faktory ovlivňující hybridizaci •Teplota, koncentrace solí a pH •Specificita hybridizace se zvyšuje v pufru o nízké koncentraci solí, vyšším pH a při vyšší teplotě •Specifitu hybridizace lze zvýšit chemickými látkami (např. formamidem – snižuje hydrofobní interakce mezi basemi a jejich nespecifické párování) Další faktory ovlivňující stabilitu hybridů •Stupeň vzájemné komplementarity bazí •Zastoupení GC a AT párů •Přítomnost látek destabilizujících vodíkové vazby mezi řetězci (např. denaturační činidla – formamid, močovina) Tm •Je teplota, při které jsou sonda a cílová sekvence z 50% denaturovány •Tm = 81,5ºC + 16,6 logM + 0,41 (%GC) •M… iontová síla pufru v molech/l • •Přibližné Tm •Tm = 4x (počet GC) + 2 (počet AT) Srovnání hybridizace za různě stringentních podmínek •Obr. Za podmínek nízké stringence •Se sonda specifická pro 16S r RNA sekvenci Staphylococcus aureus •Může vázat na příbuzné sekvence jiných druhů Staphylococcus, jsou-li v analyzovaném vzorku přítomny •To vede k falešně pozitivním výsledkům •! Podmínkám hybridizace musí být věnována mimořádná pozornost •Na druhou stranu za podmínek nízké stringence můžeme vyhledávat příbuzné sekvence genů Hybridizace je využíváno •K vyhledávání a charakterizaci specifických nukleotidových sekvencí •V genových/genomových knihovnách •V cytologických preparátech •Při mapování genomu atd. •DNA/DNA hybridizace •DNA/RNA hybridisace •RNA/RNA hybridisace Příprava sondy •Tj. příprava jednořetězcové značené nukleotidové sekvence DNA nebo RNA •Která se váže na cílovou sekvenci •A kterou lze podle značky sondy identifikovat Jako sondu lze použít •Jakoukoliv vhodně označenou molekulu DNA nebo RNA Velikost sondy •Může být různá •Obvykle bývá 100 – 1000 bp •I mnohem větší Pro přípravu sond se používají •Celková DNA •Plasmidová DNA •Sekvence genomové DNA nebo cDNA klonované ve vektoru •Nebo amplifikované v PCR •Uměle syntetizované nukleotidy o délce 15-70 bází (jejich sekvence může být odvozena ze sekvence AK proteinu, jehož kódující oblast na DNA vyhledáváme) •Sekvence genů příbuzných organismů, u nichž existuje vysoká pravděpodobnost, že připravená sonda rozezná sekvenci homologních genů Příklady komerčně dostupných sond •Pro přímý průkaz patogenních mikroorganismů a virů či pro konfirmační testy •Obr. Značení sond •Radioaktivní značení •Neradioaktivní značení Při radioaktivním značení •Jsou do sekvence sondy začleněny nukleotidy (dATP), obsahující radioaktivní izotop (3H, 32P, 35S) •Signálem sondy je radioaktivní záření, které lze detekovat pomocí scintilačního stanovení radioaktivity v roztoku nebo autoradiograficky Autoradiografie •Detekce a lokalizace radioaktivní značky zabudované na pevném nosiči •Využívá změn fotografické emulse (ionty Ag), které jsou vyvolány záření, emitovaným izotopem (β- částice 3H, 14 C, 35S, 32 P, γ-částice 125I) •Po vyvolání fotografické emulse se získá negativ s černými skvrnami v místě, kam doletěly emitované paprsky •Snížení teploty na -70ºC zvyšuje stabilitu atomu Ag a tím se prodlouží doba pro zachycení druhého fotonu. Dva typy autoradiografie •Přímá – vzorek se umístí přímo na film •Nepřímá – záření je převedeno na světlo pomocí scintilátoru, jímž je napuštěna speciální deska. Radioaktivní záření přenáší energii na molekuly scintilátoru, ty emitují fotony, které ozařují fotografickou emulsi. •(Ukázka desek) Při neradioaktivním způsobu značení •Jsou do sekvence sondy zabudovány chemicky modifikované nukleotidy nesoucí reportérskou molekulu, která umožňuje přímou nebo nepřímou detekci sondy Enzymové značení sond a jejich detekce •Enzymové značení sond – enzymy alkalická fosfatáza AP, křenová peroxidáza POD, luciferáza – detekce s využitím specifického substrátu •po přidání substrátu katalyzuje příslušný enzym reakci, jejichž výsledkem je podle povahy substrátu změna jeho barvy - kolorimetrická detekce – nebo změna rozpustnosti, nebo emise světla •(Substrátem pro AP je BCIP-NBT (5-bromo-4chloro-3-indolylfosfát-NitroBlueTetrazolium)) • • • • Využití afinitních značek •biotin, digoxigenin navázané na nukleotid (dUTP) a inkorporovány do sond •detekce s využitím streptavidinu nebo avidinu nebo protilátky s přikonjugovaným enzymem AP, POD •(tj. nepřímá generace signálu) • Vysvětlení chemické podstaty značek •Biotin – vitamin H (řadí se do skupiny vitaminů B, je přítomen ve všech b.) •Digoxigenin – rostlinný steroid (Náprstník) •Avidin- bílkovina ve vaječném bílku •Streptavidin – bakteriální protein izolovaný ze Streptomyces avidinii Obr. •Hybridizace s využitím biotinylované sondy a detekce Využití chemiluministentních molekul •chemiluminiscentní molekuly (např. estery akridinu, které emitují světlo po vystavení určitým substrátům - detekce pomocí specifického filmu nebo luminometru) • Využití fluorescenčních molekul •Fluorescenční molekuly (např. fluorescein, rhodamin) • fluorescenční značky různé barvy lze detekovat ve fluorescenčním mikroskopu • Výhody neradioaktivně značených sond •Výhody: bezpečnost práce •delší životnost sondy (stabilní několik měsíců až rok) (radioaktivně značené sondy mají krátkou životnost – dle použitého izotopu a jeho poločasu rozpadu) •Rychlejší výsledek Nevýhody neradioaktivně značených sond •Nevýhody: nižší citlivost (výsledky získané s radioaktivními sondami jsou považovány za standardy maximální citlivosti) •Obtížná kvantifikace • Výhody afinitních sond s nepřímou generací signálu • • •Velkou výhodou afinitních značek je, že pro stejnou značku mohou být použity různé systémy generující signál (např. u sondy značené biotinem může být použit avidin s připojenou fluorescenční skupinou nebo s enzymem (AP, POD) •Specifická aktivita sondy (tj. počet inkorporovaných afinitních skupin/1 sondu) není tak významná jako dostupnost těchto afinitních skupin pro následující detekci po hybridizaci Metody značení sond •Buď po celé délce fragmentu NK •Nebo na jejím konci (koncové značení) •S využitím značených nukleotidů, které se přidávají do reakční směsi Značení nukleotidů •Radioaktivní – např. na fosfátové skupině dNTP je zabudován radioaktivní isotop – Obr. •Neradioaktivní značka (např. digoxigenin) bývá přisyntetizována na bázi přes můstek (spacer), aby nebyla ovlivněna hybridizace – Obr. • Metoda posunu jednořetězcového zlomu („nick translation“) •Vnitřní značení, pro fragmenty větší •Na ds DNA se vytvoří DNázouI náhodné ss zlomy •Ty jsou substrátem pro působení DNA-polymerázyI •odstraňuje svou exonukleázovou aktivitou nukleotidy od místa zlomu ve směru 5´-3´ •a současně ve stejném směru připojuje nukleotidy k 3´konci zlomu •Značka musí být u dNTP na fosfátové skupině alfa • Metoda prodlužování primeru •S využitím náhodných oligonukleotidů (hexamery), u fragmentů kratších •Výchozí molekula je denaturována •K ss molekulám se přidá směs synteticky připravených hexamerů s náhodnou sekvencí (random priming) •Tyto oligonukleotidy se přihybridizují k různým místům DNA a slouží jako primery pro syntézu komplementárního řetězce Klenowovým fragmentem DNA polymerázyI, •která postrádá 5´-3´exonukleázovou aktivitu (aby se zabránilo odbourávání primerů) •Lze využít rovněž zpětnou transkriptázu •Obr. • Značení pomocí PCR s využitím primerů o známé sekvenci •Jako matrice slouží naklonované fragmenty DNA nebo celková genomová DNA •Pomocí PCR a značených dNTP lze získat sondu z přesně definovaného úseku DNA, vymezeného místem připojení primerů •K polymerazi se používá Taq DNA polymeráza Značení transkripcí in vitro •Když je DNA naklonována za promotor •Jako sonda se použije RNA transkript dané sekvence DNA vzniklý za přítomnosti ribonukleotidů – RNA sonda •S využitím reverzní transkriptázy lze získat cDNA sondy Koncové značení řetězců na 5´konci •Pro značení synteticky připravených oligonukleotidů nebo restrikčních fragmentů •Značení na 5´koncích nejčastěji radioaktivním fosfátem pomocí polynukleotidkinázy (v ATP radioaktivně značena fosfátová skupina gama) •Lze značit ss i ds DNA molekuly •Obr. Koncové značení řetězců na 3´konci •3´konce lze značit metodou doplnění konců – k přesahujícím jednořetězcům na koncích restrikčních fragmentů jsou dosyntetizovány komplementárně označené nukleotidy enzymem DNA polymerázou •K 3´koncům lze připojit značené nukleotidy působením terminální transferázy •Nukleotidy nesou značku na fosfátové skupině alfa Pro přípravu hybridisačních sond •Může být použita peptidová nukleová kyselina (PNA) •Molekula analogická DNA •její kostru tvoří opakující se N-(2-aminoetyl)-glycinové jednotky spojené peptidovou vazbou •Báze se na kostru vážou metylen-karbonylovými skupinami •PNA napodobuje chování DNA PNA sondy • •Jsou vysoce afinitní k DNA a průběh hybridizace je velmi rychlý •Interakce PNA:DNA je vysoce selektivní, může probíhat při laboratorní teplotě a může ji destabilizovat pouhý 1 chybný pár bazí •Sondy tohoto typu jsou vhodné pro detekci jednonukleotidových polymorfismů. •Jsou značeny barvivem, které po vazbě sondy na DNA fluoreskuje až 50x intenzivněji než u nenavázané sondy a signál je proto viditelný i pouhým okem. • •PřF 27.9.2011