Speciální metody analýzy mikroorganismů . Enzymy používané k úpravám nukleových kyselin •lze klasifikovat podle substrátové specifity •podle typů reakcí Enzymy lze klasifikovat podle substrátové specifity •na enzymy, •jejichž substrátem je DNA •jejichž substrátem je RNA Enzymy podle typů reakcí, které katalyzují lze klasifikovat • •Na enzymy •Syntetizující NK (polymerázy) •Modifikující NK (fosfatázy, metylázy, kinázy) •Spojující nukleotidové řetězce (ligázy) •Odbourávající NK (nukleázy) • Enzymy syntetizující nukleové kyseliny • •DNA polymeráza I (DNA-polI) (E.coli) katalyzuje 3 odlišné reakce, jejichž rychlost je ovlivněna stavem DNA a koncentrací dNTP v reakční směsi •degraduje polynukleotidový řetězec ve směru 5´-3´ •degradovaný řetězec nahrazuje novým (značení DNA metodou tzv. posunu jednořetězcového zlomu) •má 3´-5´exonukleázovou aktivitu Enzymy syntetizující nukleové kyseliny •Klenowův fragment DNA – polymerázy I (Klenowův enzym, velký fragment DNA-polI) •větší peptidový fragment vznikající po štěpení DNA-polI subtilizinem •má 5´-3´polymerázovou aktivitu a •3´-5´ exonukleázovou aktivitu •Postrádá 5´-3´ exonukleázovou aktivitu •Používá se při enzymové metodě sekvencování (nesmí docházet k odbourávání primerů) •Při značení DNA s využitím hexanukleotidových primerů Enzymy syntetizující nukleové kyseliny •Terminální deoxyribonukleotidyltransferáza •Z telecího brzlíku •Katalyzuje připojování nukleotidů k 3´koncům DNA •Nevyžaduje matrici ani primer (na rozdíl od DNA polymerázy) •Používá se ke koncovému značení NK • a k připojování homopolymerních konců k fragmentům DNA a vektorovým molekulám se zarovnanými konci (pro vytvoření komplementárních úseků, které umožní jejich spojení) Enzymy syntetizující nukleové kyseliny •Zpětná transkriptáza •Retroviry např. virus ptačí myeloblastózy •Využíván k připravě cDNA z mRNA (zpětná transkripce) •Zpětných transkriptů se využívá k sekvencování RNA a při připravě cDNA sond pro hybridizaci Enzymy modifikující NK •Alkalická fosfatáza •Telecí střevo, baktérie •Odstraňuje fosfátové skupiny z 5´-konců DNA, RNA a oligonukleotidů •Využívá se při koncovém značení molekul, •při klonování k zabránění recirkularizace vektorů a tvorby dimerů • Enzymy modifikující NK •T4-polynukleotidkináza •Buňky E. coli infikované bakteriofágem T4 •Enzym katalyzuje přenos fostátové skupiny z ATP na 5´OH skupinu DNA nebo RNA •Výměnu fosfátových skupin na 5´konci •Používá se ke značení fragmentů NK na 5´ koncích např. pomocí radioizotopu P (32P) Enzymy spojující nukleotidové řetězce •T4-DNA-ligáza •Buňky E. coli infikované bakteriofágem T4 •Katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby mezi 5´-fosfátovou skupinou a 3´-OH skupinou sousedního nukleotidu •Používá se ke spojení dvou molekul DNA zakončených komplementárními konci •K připojení spojek a adaptorů, k cirkularizaci lineárních molekul •Lze jí využít i ke spojení fragmentů se zarovnanými (tupými) konci (na rozdíl od DNA-ligázy E.coli) Enzymy odbourávající nukleotidové řetězce •Exonukleáza III •E.coli •Působí ve směru 3´- 5´ a na ds DNA odstraňuje od jejího 3´konce jedno vlákno •Působí pouze na DNA, jejíž konce mají přesahující 5´- konec (ne 3´-konec) nebo jsou zarovnány •Využívá se k vytváření jednosměrných delecí (druhý řetězec je odstraněn S1 nukleázou) Enzymy odbourávající nukleotidové řetězce •Exonukleáza Bal31 •Alteromonas espejiana •Štěpí lineární ds DNA od obou konců za vzniku zkrácených fragmentů DNA se zarovnanými konci •Je používána k přípravě obousměrných delecí Enzymy odbourávající nukleotidové řetězce •Nukleáza S1 •Aspergillus oryzae •Endonukleáza specifická pro ss DNA •Používá se k odstraňování jednořetězcových úseků na dsDNA, smyček na cDNA, vznikajících při její syntéze, při mapování intronů analýzou hybridních molekul DNA-mRNA •Po štěpení S1-nukleázou jsou konce DNA často heterogenní a chybějící úseky musí být zaplněny DNA polymerázou Enzymy odbourávající nukleotidové řetězce •Deoxyribonukleáza - DNázaI •Hovězí pankreas •štěpí nespecificky •Za přítomnosti Mg2+ vytváří na DNA ss zlomy, od nichž pak DNA dále degraduje na mono- a oligonukleotidy •Za přítomnosti Mn2+ dochází ke vzniku zlomů v protilehlých místech (ds zlomy) •Používá se při značení DNA, pro zavádění mutací •Ve větších koncentracích se používá k odstranění DNA při izolaci RNA • Enzymy odbourávající nukleotidové řetězce •Ribonukleázy - Ribonukleáza A •z hovězího pankreatu •k odstranění RNA z roztoků DNA používána •Ribonukleáza T1 je sekvenčně specifická, využívá se při analýze a sekvencování RNA • • • Enzymy odbourávající nukleotidové řetězce •Restrikční endonukleázy – restriktázy typu II •Sekvenčně specifické, produkované kmeny většiny bakteriálních druhů •V současné době je jich známo víc než 3500 •K rozštěpení molekuly DNA dochází hydrolýzou fosfodiesterových vazeb obou řetězců v restrikčním místě neboli místě štěpení, které se nachází uvnitř rozpoznávacího místa nebo těsně vedle něho •Produktem štěpení jsou restrikční fragmenty •Restriktázy jsou používány v genových manipulacích při izolaci specifických fragmentů DNA, při tvorbě rekombinantní DNA, při fyzikálním mapování genomů. •Známo 3500 enzymů •PřF 1 .10.2011