Metodologie molekulární fylogeneze a taxonomie hmyzu Bi7770 Andrea Tóthová MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE CZ.1.07/2.2.00/15.0204 PF_72_100_grey_tr ubz_cz_black_transparent Metodické přístupy stanovení primární struktury DNA •Historie: – – –1953: struktura DNA (James Watson a Francis Crick; Nature, NC 1962) –1964: NC 1968 rozluštění genetického kódu (Nirenberg M. a Matthaei H.) –1977: sekvenování chemickou degradací – neenzymatické štěpení DNA (Allan Maxam a Walter Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA) –1977: sekvenování terminátorovou metodou (Frederick Sanger, Proc.Natl.Acad.Sci.USA) –1986: objev PCR (Mullis; NC, dr.h.c. LF MU) •Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., and Erlich H. (1986). Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 51 Pt 1:263–373 •Aktuální stav: –1996: sekvenování druhé generace – pyrosekvenování (Nyrén P., Ronaghi M. ; Stockholm), 454 sekvenování Roche/454, Illumina Genome Analyzer IIx, Life Technologies SOLiD 4 a další –21. století: sekvenování třetí generace – SMRT (single molecule real-time) – 2008; 2013 (Pacific Biosciences)??, nanotechnologie, hmotnostní spektrometrie, konfokální laserové spektrometrie a další – •Výběr technologie závisí od plánovaného využití analýz Kapitola 1 – Technologie sekvenování MAXAM - GILBERTOVA METODA • •A. M. Maxam a W.Gilbert-1977 • • •Sekvence DNA je vystavena určitým chemikáliím, které nasekají vlákno ve specifických místech (nukleotidech) • Maxam-Gilbert •ds DNA •Radioaktivní značení 5´konce ds molekuly [γ-32P] ATP (alkalická fosfatáza, polynukleotid kináza) •Denaturace a separace vláken •Chemická modifikace vlákna - metylace (G-dimetylsulfát, AT-kyselina mravenčí, CT-hydrazín, C-NaCl s hydrazínem) •Selekční štěpení metylací piperidinem •Elektroforéza •Autoradiografie •Vysoko radioaktivní látka, poločas rozpadu 14 dní, několik desítek bazí na gelu • •Dnes se již nepoužívá Sanger – Coulson – (Nicklen) •Syntéza komplementárního vlákna z ss DNA templátu – restrikční fragmenty (reakční pufr; dNTPs; DNA pol I – Klenow fragment, T7 DNA pol, Taq DNA pol) •Radioaktivní značení vznikající molekuly [α-32P]dATP, [α-35S]dATP (alkalická fosfatáza, polynukleotid kináza) •Složitá inkubace ve vícero krocích (annealing, amplifikace) •Přidání terminátorů ddNTPs – postupní terminace (poměr dTTP:ddTTP) •Nutnost terminace reakce (formaldehyd, chelatační činidlá, barviva) •Elektroforéza – 6-8% PAGE + TBE (TEMED, močovina, bis-akrylamid) •Autoradiografie vysušeného gelu (24-48 hod) a následní detekce •Radioaktivní látka, 30 nt od primeru – max 400 nt • •Prodloužení délky čteného vlákna •Modifikace chemie (nahrazení radioaktivního značení) •Modernizace metod analýzy syntetizovaných fragmentů, automatizace SANGEROVA metoda •Nejpoužívanější zůsob sekvenování • •Objeveno Frederickem Sangerem - 1977 • •Nobelova cena - 1980 • • • • 8HTJZBCAPKS1U8CA9OD6D7CA37LSHWCAF37RLPCARRJBETCAGD1RG2CACGN9OFCAP3XIZZCA2LCO2ZCA4WGEA6CAWIR5GECAZ3W RFZCAIAHP0XCAXSWE0ZCAJCUPOYCAZL1J8JCAHDXOR8CANC890ACAGHCHPH dideoxynukleotidy Nahrazení radioaktivního značení fluorescenčními barvičkami •Oligo – hybridizační sondy •Radioaktivní nuklidy: 3H, 32P, 35S, 125I •Detekce záření na scintilačním fotometru nebo autoradiografií na RTG filmu •3´ i 5´, celé fragmenty: DNA I pol Klenow fragment, T4 DNA pol, T4 polynukleotid kináza, alkalická fosfatáza (BAP, CIP) • •Fluorochromy – široké spektrum a využití v biologii •6-FAM, NED, PET, ROX, HEX, VIC, JOE, LIZ, BigDyes •Detekce fluorescenčního záření: laser + indukční a emisní spektrum fluorochromu – excitace fluorochromu – detekce přes optický systém (CCD kamera; vzduchem chlazený CCD čip) – virtuální filtrování – vlnová délka se odečítá pouze v oblasti spektrálního maxima •Ovlivnění mobility fragmentů sequencing_analysis •Solid – Life Technologies-Applied Biosystems •Detekce fluorescence •Kombinace dvou nukleotidů, vícero primerů •Galaxy software SOLID chemie Ion Torrent technologie •Nejnovější technologie •Celogenomový •Personální využití – PGM systém •Detekce změny pH 454-pyrosekvenování •454 Life Sciences - komercializace •Sekvenovíní druhé generace •Celogenomové •4 enzymový systém –DNA polymeráza –ATP sulfuryláza –Luciferáza –Apyráza •Detekce nukleotidu začleněného do nově-syntetizovaného vlákna pomocí luminiscence •Roche – GS FLX Titanium, GSJunior strana 15 heterozygot sequencing_analysis Přístrojové vybavení •Klasická vertikální elektroforéza •Gelové sekvenátory – plošné PAGE gely, ruční příprava –Applied Biosystems, Bio-Rad, Beckman •Kapilární sekvenátory – komerčně dostupné polymery – denaturační / nedenaturační, automatické „nanášení“ vzorků, elektroforéza v kapiláře –(Applied Biosystems, Amersham Pharmacie BioTech, Beckman) •ABI PRISM 310, 3100, 3100-Avant, 3730, ABI 3500 Genetic Analyzer; MegaBACE 500, 750, 1000, 15000, 4000; CEQ 8000, CEQ 8800 •1986 – 1. sekvenátor (Perkin-Elmer) •Gelové poloautomatické sekvenátory •Vývoj úrovně automatizace – princip kapilární elektroforézy •1 – 4 – 8 – 16 – 24 – 96 kapilár •Vývoj ovládacího softwaru •Vývoj kvality, kvantity a rychlosti zpracování vzorků •Sekvenování první generace – Sanger – do 1000 bp •Sekvenování druhé generace – celogenomové – paralelní sekvenování amplifikovaného DNA templátu – 3 Gbp/run→20 Gbp/run →100 Gbp/run •Sekvenování třetí generace – rychlé a dlouhé čtení – sekvenování jedné molekuly Ion Torrent Převzato od Martin Beránek, UKBD Hradec Králové ABI PRISM 3100 Avant POP6 ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer a metoda sekvenování •Automatický autosampler •Plata pro 96 vzorků •4 kapiláry – paralelní runy •Pícka •Detekční prostor (laser, optika, CCD kamera, okénko kapiláry) •Katody a anoda •Elektroforetický pufr •Dávkování polymeru – systém stříkaček •Ovládací software Možnosti ABI Prism 3100-Avant Dye terminatror chemistry primer Dye primer chemistry v3-1 cykler Princip metody sekvenování na ABI Templát – koncentrace, čistota Primer - specifita Pufr dNTP ddNTP Taq DNA polymeráza Postup: purifikace DNA templátu – PCR amplifikace a přečištění produktu – cyklické sekvenování – přečištění sekvenační reakce – kapilární elektroforéza – analýza dat Princip práce stroje •Ovládání softwarem – DataCollection •Elektrokinetická injektáž – objem vzorku zůstává nezměněn •Pohyb fragmentů DNA gelem (polymerem) v elektrickém poli •Definování správných podmínek runu (modul) – bere v úvahu směs použitých fluorochromů, délku kapiláry (50-80 cm), polymer (POP6)… •Detekce emise fluoroforu při přechodu detekčním okénkem •Převod dat: spektra – raw data – elektroforetogram •Vyhodnocení a analýza sequencing_analysis seqscape Sequencing Analysis Software v5.1 SeqScape Software v2.1 Sequence Scanner v.1.0 Aplikace a využití metody sekvenování •Sekvenování de novo •Resekvenování •detekce mutací – SNP, INDELs (nutné rozklonování PCR produktů k detekcím jednotlivých alel) Mikrosatelity – definice a využití •STR, SSR – jednoduché motivy, VNTR – složité motivy •Různé typy motivů v tandemovém opakování –Mononukleotidový motiv – jednoduchá repetice (polyA) (A)n –Dinukleotidový motiv – nejčastejší v panelech v určování původu hospodářských zvířat (GT)n –Trinukleotidový motiv – vhodnější na odečet (panely u psů) – kombinace s di-nt motivy v panelech (GTC)n –Tetranukleotidový motiv – panely pro určování původu u zvířat i lidí, vhodné na odečet, ne tak časté (ATCT)n –Složené motivy – složité sekvence – zejména u nižších živočichů •Bythinella GA(CA)3(GACA)4(GA)2(CA)2(GA)22CA(GA)7CA(GA)4CA(GA)4CA(GA)7 •Gammarus • [(CAT)2CACC(CAT)2C]2(CAT)2CACC(CAT)5G(CAT)2CACC(CAT)2 unequal •Polymorfismus na základě variability opakování – vysoce polymorfní •Multialelické – zdroj genetické variability •Klasické Mendelovské křížení a segregace •Vznik nových alel – DNA pol. slippage, chyby v crossing-overu během meiózy •Zejména v nekódujících oblastech – intergenové oblasti (genetický balast) a intragenové oblasti (UTR, introny) Funkce a využití MS •Funkce neověřená - ochotně rekombinují, tvoří sekundární struktury (vliv na replikaci DNA a buněčný cyklus), možná regulace genové aktivity (transkripce a translace) •Využití zejména: – v populačních studiích (struktura populace, fylogenetické analýzy, geografická vazba) –forensní genetika (15 MS+amylogenin) –identifikace jedince (paternita, parentita, původ – i u zvířat – nutnost stanovení genetického profilu) –diagnostika a určování onemocnění (zvířata i lidi, vazbové markery) –konstrukce vazbových map (potřeba rodin a populací – existují již komerční kity např. ABI Prism Human Linkage Mapping Site) Velikost alel mikrosatelitních markerů a jejich variabilita •CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG •CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG •CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTATCGGTACTACGTGG • •Variabilita v opakování motivu – variabilní délka amplifikovaného fragmentu •Možná modifikace (mutace) v místě nasedání primeru – falešná homozygozita, nulové alely •Možné chyby při PCR amplilfikaci – zklouznutí DNA polymerázy, amplifikace nespecifikého místa •Přidávání adeninu na konec fragmentu •Nestabilita při amplifikaci– polymeráza dělá čím dál tím kratší fragmenty Historie hodnocení variability mikrosatelitních markerů •Genealogie – tvorba rodokmenů •PCR amplifikace variabilních míst v genomu – horizontální gelová elektroforéza (EtBr) •Fragmentační analýza kapilární gelovou elektroforézou (fluorofory) • Princip fragmentační analýzy kapilární elektroforézou FA-CE •Nezajímá nás sekvence fragmentů •Důležité – počet bazí (délka fragmentů), množství DNA (určuje výška píku) •Relativní sizovací metoda – potřeba interního standardu (alignment by time scale/size scale) •Vícero píků+artefakty – nutno odlišit konkrétní alelu •1 vs. vícero markerů – počet rozhoduje •Amplifikace polymorfního místa PCR (možnost multiplex) – důležitá kvalita a kvantita templátu (empirické stanovení) •Značení fragmentů pomocí značeného primeru (5´modifikace fluoroforem) •Separace amplifikovaných fragmentů v elektrickém poli kapilární gelovou elektroforézou CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG •Příprava vzorku pro FA – denaturační činidlo (formamid)+interní standard velikosti fragmentů •Sekvenátor •Kapilára – 36 cm, polymer POP4, matrice a spektrální kalibrace pro daný modul FA •Ovládání softwarem – DataCollection •Elektrokinetická injektáž – objem vzorku zůstává nezměněn •Pohyb fragmentů DNA gelem •Definování správných podmínek runu (modul) – bere v úvahu směs použitých fluorochromů, délku kapiláry •Detekce emise fluoroforu při přechodu detekčním okénkem •Převod dat – spektra – raw data – elektroforetogram •Vyhodnocení a analýza – GeneScan + Genotyper, GeneMapper+PeakScanner GeneMapper v 4.0. GeneScan 3.7. PeakScanner Software v.1.0 Kone rodina-zelena Kritéria pro tvorbu panelů MS markerů •Počet je rozhodující •Pokrytí celého genomu (téměř všechny chromosomy) •Co největší variabilita, množství alel •Vysoký PIC (polymorfní informační obsah) •Minimum nulových alel •Vhodnost pro multiplex-PCR •Velikostní rozpětí fragmentů alel, vliv na použití fluorochromu na značení •6-FAM, NED, PET, ROX, HEX, VIC, JOE, LIZ – možnosti 4 a 5 dye systémů Typy MS panelů •Člověk •Skot, Prase, Kůň •Psi (10), dravci – sokol (tmavý, raroh, lovecký, stěhovavý), poštolka, orel (5), jelen, kočka •Ryby (různé rody i druhy) •Bezobratlí – šneci, blešivci, mravenci, mouchy etc…malé panely lokus chromozom fluorescenční značka barva rozsah (v bp) VHL20 30 FAM modrá 83-102 HTG4 9 FAM modrá 116-137 AHT4 24 FAM modrá 140-166 HMS7 1 FAM modrá 167-187 HTG6 15 VIC zelená 74-103 AHT5 6 VIC zelená 126-147 HMS6 4 VIC zelená 154-170 ASB23 3 VIC zelená 176-212 ASB2 15 VIC zelená 237-268 HTG10 21 NED žlutá 83-110 HTG7 4 NED žlutá 114-128 HMS3 9 NED žlutá 146-170 HMS2 10 NED žlutá 215-236 ASB17 2 PET červená 104-116 LEX3 X PET červená 137-160 HMS1 15 PET červená 166-178 CA425 28 PET červená 224-247 Možnost stanovit množství DNA pomocí FA •Nezaměňovat s kvantifikací pomocí qPCR •Určení množství amplikonu pomocí výšky a plochy píku •Nepřesné a relativní – hrozí „plato efekt“ (vyčerpání systému) •Využívané při detekci onemocnění způsobenými polyploidií •Trisomie chromosomu 21 u lidí – Downův syndrom Sekvenační reakce - příprava •Templát – PCR, BAC, plazmidový vektor, •Možnosti přečištění PCR –Kolony –Purifikace fragmentu z gelu – nespecifity al. dimery primerů –SureClean •Možnosti stanovení koncentrace PCR produktu po purifikaci –Spektrofotometricky –Gelová elektroforéza – porovnání velikosti a koncentrace s markerem –Na základě fluorescence – Qubit –Nanodrop – kvalita i kvantita (koncentrace DNA při 260 nm, do up to 3700 ng/ul bez ředění) •Reagencie sekvenační PCR –Typy sekvenačních kitů –Tabulka využití •Teplotní profil reakce – klasický vs. fast strana 51 Kapitola 5 – Praktická část 2 – Sekvenační reakce Přečištění PCR produktu PCR_nespec PCR_dimery Stanovení koncentrace •Doporučené množství templátu do sekvenační reakce ZUZU_kvantifikace fragmenty množství DNA v ng na gelu při nanášení ředěného markeru: 20ml 10ml 5ml 2,5 ml 1,25 ml 0,625 ml 0,312 ml 1031 206 103 51,5 25,75 12,875 6,4375 3,2136 900 180 90 45 22,5 11,25 5,625 2,808 800 160 80 40 20 10 5 2,496 700 140 70 35 17,5 8,75 4,375 2,184 600 120 60 30 15 7,5 3,75 1,872 500 200 100 50 25 12,5 6,25 3,12 400 80 40 20 10 5 2,5 1,248 300 60 30 15 7,5 3,75 1,875 0,936 250 50 25 12,5 6,25 3,125 1,5625 0,78 200 80 40 20 10 5 2,5 1,248 150 30 15 7,5 3,75 1,875 0,9375 0,468 100 60 30 15 7,5 3,75 1,875 0,936 50 40 20 10 5 2,5 1,25 0,624 marker (v µl) PCR 20 10 5 2,5 1,25 0,625 Reagence sekvenační PCR a možnosti modifikace teplotního profilu Nové sekvenační kity BigDye Direct Cycle Sequencing Kit M13-tailed PCR primery Výhody vs. nevýhody Možnosti přečištění sekvenační reakce a příprava vzorku k analýze •Ethanol (inhibitor) •Kombinace kolony a ethanol – odstraní víc neinkorporovaných terminátorů •BigDye X-Terminator Kit –Není potřeba pracovat s formamidem (teratogen) –když zkrátíme dobu třepání, neubere tolik krátkých fragmentů –Platíčkové verze – minimum pipetování ETOh Příprava stroje před runem – běžný uživatel