Genetické metody v zoologii DNA Msat paternita - barvy Fig1 Josef Bryja (bryja@brno.cas.cz) Miloš Macholán (macholan@iach.cz) c2macholan zobraz_fotku Sylabus 1. Úvod; Analýza NK I (izolace DNA, genetické markery - jaderná vs. mimojaderná DNA, PCR, real-time PCR, sekvencování) JB 2. Analýza NK II ("single-locus" DNA markery: mikrosatelity, LINE, SINE) JB 3. Analýza NK III (SNP a jejich analýza: RFLP, DGGE, TGEE, SSCP, klonování) JB 4. Analýza NK IV (celogenomové metody, multi-locus" DNA markery: fingerprinting, RAPD, AFLP; next generation sequencing a jeho aplikace; analýzy exprese, transkriptomika) JB 5. Analýza fenotypu (signální fenotypy, kvantitativní znaky, analýza landmarků); Cytogenetika (analýza karyotypu, proužkování, FISH, „painting“); Elektroforéza enzymů MM 6. Metody analýzy I (základy bioinformatiky, dostupné zdroje dat - GenBank, BLAST atd., alignování sekvencí atd.) MM Sylabus 7. Metody analýzy II (fylogenetická data) - metody založené na vzdálenosti, maximální parsimonie, maximální věrohodnost, Bayesiánské metody MM 8. Metody analýzy III (populačně-genetická data) - analýzy založené na frekvencích alel v populaci, "individual-based" modely JB 9. Praktické cvičení v laboratoři I (zhotovení chromozomálních preparátů, analýza karyotypu) MM 10. Praktické cvičení v laboratoři II (PCR, real-time PCR) JB 11. Praktické cvičení v laboratoři III (analýza DNA fragmentů po PCR, elektroforéza, fragmentační analýza, SSCP v kapiláře) JB 12. Praktické cvičení v laboratoři IV (sekvencování) JB Doporučená literatura (česká) Genetické metody v zoologii Jan Zima, Miloš Macholán, Pavel Munclinger, Jaroslav Piálek Nakladatelství Karolinum 2004 SANY0231 Proč? Problém: zoologie, taxonomie ekologie, evoluce klasické metody morfologická, ekologická, bionomická data Genetické metody: genetická data Další úroveň poznání Odpovědi na nové otázky Proč používat genetické metody v zoologii? n nČasto nelze jinak či lépe: nrekonstrukce fylogenetických vztahů mezi populacemi , druhy či vyššími taxony n npaternita – páření často skryté a nemusí vést k oplození n nidentifikace z trusu, chlupů - pohyb jedinců skrytě žijících druhů n nizolace populací – nemusí být zřejmá npočet migrantů – nelze sledovat naráz všechny jedince n n viz Molekulární ekologie – letní semestr Úrovně genetické variability ndruh – fylogenetické analýzy (fylogenetická systematika, identifikace druhů) npopulace – studium speciace, fylogeografie Úrovně genetické variability Úrovně genetické variability npopulace – populační biologie, ochranářská genetika) Pracovní_hýli ? Úrovně genetické variability njedinec – analýzy příbuznosti (behaviorální ekologie, např. analýzy paternity) Genetické markery nkódující DNA (geny) npřepisované sekvence ngenetický kód nvytvářejí fenotyp npodléhají přírodnímu výběru nrostoucí význam v přírodních vědách nnekódující DNA nnefunkční (neznámá funkce) nneutrální k přírodnímu výběru nvětšina DNA u eukaryot (až 95% u obratlovců) npseudogeny nrepetitivní DNA Repetitivní DNA DNA Typical sequence length (bp) Location Satellites (>106 repeats/genome) 5-100 Tandem arrays, scattered throughout the genome Minisatellites (>103 loci/genome) 20-300 Tandem arrays up to 5 kb in length, scattered throughout the genome Microsatellites (>104 loci/genome) 1-6 Tandem arrays up to a few 100 bp in length, scattered throughout the genome Telomeres 4-8 Tandem arrays up to 1kb in legth, at the ends of each chromosome SINEs (>105/genome) 50-500 (100-300) Interspersed throughout the genome LINEs (>103/genome) 1-5 k Interspersed throughout the genome Kódující („funkční“) DNA 1)ribosomal DNA 2) 2)nuclear structural (protein coding) genes 3) 3)mitochondrial DNA 1. Ribosomal DNA • genes for ribosomal RNA – repeated clusters in eukaryotes • 16S, 23S, and 5S – single copy cluster in prokaryotes • rDNAs – phylogeny, ITS – population structure 2. Nuclear structural genes nnízká variabilita mezi jedinci – významná funkce, purifikující selekce (nejsou často používány jako genetické markery) nalozymy nMHC geny nSNPs – narůstající význam (jednoduché mutace způsobují významnou funkční změnu) nstudium transkripce - transkriptomika 3. Mitochondrial DNA Saccone et al. 2001 • maternaly inherited (?) • no recombination (?) • phylogeography • « numts » nuclear copies of mtDNA • multiple copies 14 kbp (Caenorhabditis) 42 kbp (Placeopecten) „Molekulárně-genetické“ metody nanalýza polymorfismu DNA nkonzervativní vs. variabilní úseky (« loci ») nsekvenční polymorfismus: CGCATCTCTAGCTTCGATTCAGGAA CGCATCTCTAGCTTTGATTCAGGAA „Molekulárně-genetické“ metody nanalýza polymorfismu DNA nkonzervativní vs. variabilní úseky (« loci ») nsekvenční polymorfismus ndélkový polymorfismus CGCACATCTCTAGCTTCGATTCAGGAA CGCATCTCTAGCTTTGATTCAGGAA Vznik DNA polymorfismu nmutace (transice, transverze, inzerce, delece) nrekombinace (kombinace změn vzniklých mutacemi, duplikace a delece při rekombinačních chybách) ntranspozice nÞ obecná molekulární genetika Genotypizace – stanovení genotypu nstanovení formy určitého úseku DNA (alely, haplotypu) n 1)izolace celkové DNA z tkání 2)amplifikace požadovaného úseku DNA (PCR-based methods) 3)studium variability daného úseku (lokus) 4) Izolace DNA nrozmanitý biologický materiál – musí obsahovat buněčná jádra nebo mitochondrie s nedegradovanou DNA ndnes většinou komerční kity nvelký vliv fixace vzorků n n nIzolace RNA (exprese specifických genů) – dříve problém, dnes RNAlater Způsoby získání DNA z volně žijících živočichů: 1.destrukční – živočich je usmrcen kvůli získání tkání potřebných na genetické analýzy 1. 2. nedestrukční (invazivní) – živočich je odchycen a je mu odebrán vzorek tkáně nebo krve n 3. neinvazivní – zdroj DNA je „zanechán za živočichem“ a je získán bez potřeby odchytu, manipulace či dokonce pozorování Fixace materiálu nčerstvá tkáň nčistý EtOH nrychlé vysušení nspeciální extrakční pufry nzamražení nformaldehyd nopakované zamražování nrozvlhčování sušeného materiálu ndalší fixační média + - § speciální metody pro izolaci ze subrecentního materiálu (mamuti, hmyz v jantaru, neandrtálci apod.) PCR Polymerase chain reaction (jak z málo DNA udělat hodně) Amplifikace DNA – PCR Druh Velikost genomu (bp) Počet chromozómů (1n) Caenorhabditis elegans 8,0 x 107 4 Drosophila melanogaster 1,65 x 108 4 Xenopus laevis 3,0 x 109 18 Mus musculus 3,0 x 109 20 Homo sapiens 3,0 x 109 23 PCR nZ celkové DNA si namnožíme jen úsek, který nás zajímá. n nCo se bude množit? To určí primery. n nPrimery – krátké oligonukleotidy komplementární k úsekům ohraničujícím místo našeho zájmu. n primer AGGGGACGTACACTCAGCTTT templát TCCCCTGCATGTGAGTCGAAA primer primer DNA templátu tento úsek se bude množit Denaturace (obvykle 95°C) při zvýšení teploty se oddělí komplementární vlákna DNA Při ochlazení dojde k reasociaci Primery přidané v nadbytku kmitají díky Brownově pohybu Některé se dostanou do blízkosti komplementárních míst Při ochlazení primery přisednou rychleji než dojde k vzájemné reasociaci dlouhých vláken DNA (obvykle 50 - 65°C) – „annealing“ V úseku mezi primery zůstanou vlákna DNA oddělena Primery jsou prodlužovány přidáváním nukleotidů podle sekvence templátu (obvykle 72°C – optimum pro Taq polymerázu) > Při dalším zahřátí dojde k oddělení templátu a nově vzniklých vláken Po ochlazení primery přisednou na templát i nově vzniklé fragmenty („annealing“) > Při 72°C dojde opět k prodlužování primerů a vzniku nových kopií Při dalším zahřátí… > Ochlazení – nasednutí primerů 72°C vznik nových fragmentů 95°C denaturace Inhibice PCR vysokou koncentrací DNA PCR Příklad programu 95°C 3 min 95°C 30 s 60°C 30 s 72°C 1 min 35x zpět 72°C 10 min Cykly (obvykle 20-40): denaturace (95°C ) nasednutí primerů (50-65°C ) elongace=polymerizace (72°C ) Nejprve však často prodlužená denaturace celkové DNA Nakonec prodloužená elongace • pcr Cycler MJ Research Cycler Eppendorf RoboCycler Stratagene Co když PCR nefunguje? nMěníme teplotu „annealingu“ (nejlépe použijeme gradient teplot, pokud to náš cykler umí) Vyšší teplota=vyšší specificita nMěníme koncentraci Mg2+ iontů nNavrhneme nové primery Studium variability nasyntetizovaného úseku 1)délkový polymorfismus nelektroforéza Rozdělení fragmentů DNA podle velikosti nAgarosa - Hrubé rozdělení (do rozdílu 15 bp) n nPolyakrylamid – Přesnější rozdělení (4 bp) n nSekvenátor, fragmentační analýza – nejpřesnější (fluorescenčně značené PCR fragmenty, např. značené primery) tools_1a 3LOKCELE detektor laserový paprsek - + Studium variability nasyntetizovaného úseku 2)sekvenční polymorfismus nsekvencování nSNP („single nucleotide polymorphism“) analýza – mnoho různých metod - použitá metoda analýzy PCR produktu závisí na typu markeru REAL TIME PCR (= „kvantitativní PCR“) SANY0264zmenseny In this presentation, we will be using Sybr green to monitor DNA synthesis. Sybr green is a dye which binds to double stranded DNA but not to single-stranded DNA and is frequently used to monitor the synthesis of DNA during real-time PCR reactions. When it is bound to double stranded DNA it fluoresces very brightly (much more brightly than ethidium bromide does, which is why we use Sybr Green rather than ethidium bromide; we also use Sybr green because the ratio of fluorescence in the presence of double-stranded DNA to the fluorescence in the presence of single-stranded DNA is much higher that the ratio for ethidium bromide). Other methods can also be used to detect the product during real-time PCR, but will not be discussed here. However, many of the principles discussed below apply to any real-time PCR reaction. Problém •Kvantitativní rozdíly v expresi genů (tj. množství mRNA) • •Neinvazivní metody – nutnost stanovit, kdy je ještě ve vzorku dostatek DNA pro smysluplnou analýzu • •Genotypizace SNPs atd. • • • Real time PCR was developed because of the need to quantitate differences in mRNA expression. PCR methods are particularly valuable when amounts of RNA are low since the fact that they involve an amplification step means they are more sensitive. Real-time PCR přístroje SANY0264zmenseny A gene which is to be used as a loading control (or internal standard) should have various features - see slide. Absolutní kvantifikace 1)Vytvoření kalibrační křivky 2) Real-time PCR se vzorkem s neznámým množstvím DNA, např. z trusu We can plot the Ct values for the dilutions against concentration - the result is a linear graph. It should have an excellent correlation coefficient (certainly more than 0.990). Stanovení koncentrace DNA při neinvazivních analýzách Log DNA concentration (pg) Positive PCR Allelic dropout Genotypizace jen „dobrých“ vzorků Morin et al. 2000 Relativní kvantifikace - standardy nMěření úrovně exprese (např. v různých typech tkání nebo treatement vs. non-treatement atd. nhousekeeping geny – slouží jako standard pro měření nstejný počet kopií ve všech buňkách nexprimované ve všech buňkách, nezávislé na experimentu n A gene which is to be used as a loading control (or internal standard) should have various features - see slide. Sekvenování nMaxam-Gilbertova (chemická) metoda: bázově-specifická chem. modifikace a štěpení fragmentů DNA nSangerova (enzymatická) metoda: terminace replikace pomocí ddNTP Sekvencování DNA Sekvencování DNA sekvenační reakce se značenými dideoxynukleotidy and jedním specifickým nebo universálním primerem DNA PCR produkt naklonovaný fragment Sangerova dideoxy metoda Sekvencování DNA Sanger G C G A G C T fluorescently-labelled dideoxynucleotide after denaturation Sekvencování DNA Fig1 DNA PCR product cloned fragment - + laser beam detector capillary electrophoresis G C G A G C T Sanger tools_1a •Sekvence délky 500 – 1000 bp • •4 kapiláry - destička s 96 vzorky za noc • •Jsou i sekvenátory s 96 kapilárami Příště … nSingle locus DNA markery – mikrosatelity, SINE, LINE atd….