Klonování ve vektorech řady pUC
ÚVOD:
Plazmidový vektor pBluescript M13+
Jedním z běžně používaných vektorů pro klonování v E. coli je bakteriální plazmidový vektor
pBluescript (viz obr. 1). Jeho polylinker (obsahuje cílová místa pro 16 restrikčních
endonukleáz) je umístěn v části genu lacZ kódující proximální část polypeptidu betagalaktozidázy,
což umožňuje použít k odlišení rekombinantních a nerekombinačních
plazmidů alfa-komplementace. Gen pro rezistenci k ampicilinu je využíván pro selekci
transformant.
Jako hostitelské kmeny pro tento plazmidový vektor jsou používány kmeny E. coli. Pro
klonovací experimenty je nutné použít kmenů, které jsou schopny alfa-komplementace (tj.
nesoucí mutaci lacZ M15), např. E. coli DH5α, JM83, JM101, NM522 aj.
Obrázek 1. Mapa vektrou pBluescript II SK/KS (-)
Naštěpení vektoru restrikční endonukleázou
2 μg DNA vektoru pBluescript naštěpíme v objemu 20 μl reakční směsi příslušnou RE (2
hod).
2 μl reakční směsi naneseme na agarozový gel a zkontrolujeme, zda je naštěpení vektoru
úplné.
K reakční směsi přidáme 30 μl TE pufru a provedeme purifikaci DNA (viz úloha č. 5).
Nakonec DNA rozpustíme v 10 μl TE pufru a uložíme při -20°C.
Příprava cizorodé DNA pro klonování ve vektoru pBluescript
Jako cizorodou DNA lze pro klonování použijeme PCR produkt štěpený příslušnou restrikční
endonukleázou, jejíž štěpné místo se nachází v polylinkeru (velikost restrikčních fragmentů,
které lze naklonovat je max. asi 10 kbp).
K naklonování lze použít DNA, která byla štěpena buď jednou RE, nebo dvěma různými RE
- v tomto případě dojde k tzv. orientovaném začlenění restrikčního fragmentu do vektoru, což
má řadu výhod, např. umožňuje restrikční mapování a sekvencování z definovaného konce.
Použití DNA štěpené dvěma enzymy zabraňuje její cirkularizaci a zvyšuje pravděpodobnost
vzniku rekombinantních plazmidů při ligaci vektorové a cizorodé DNA.
Přístroje: váha, DRY blok, vortex, skalpel, nerezová špachtle, etanol na, brýle, štít
Chemikálie: QIAGEN kit, nanášecí pufr, marker 2-log, T4 ligáza + pufr
POSTUP PRÁCE – Příprava vektoru a inzertu pro klonování
1. Ve sterilní Eppendorfově zkumavce připravte restrikční štěpení vektoru a inzertu s
použitím restrikčních endonukleáz EcoRI a BamHI (viz. Cvičení 2)
Vektor: pBluescript SKInzert:
500 bp fragment genu hsp60 (60 kDa chaperonin S. aureus)
Objem směsi: 50 µl
2. Štěpění provádějte 2 hodiny při 37 °C a reakci zastavte přidáním 0.8 l 0.5M EDTA.
3. Proveďte elektroforézu vzorků DNA na agarózovém gelu (viz Cvičení 3)
4. Agarózový gel obarvěte ethidiumbromidem..
Tato část úlohy (body 1-4) bude předem připravena vyučujícím.
5. Fragmenty DNA vyřízněte skalpelem z agarózového gelu a DNA vyčistěte s použitím
kitu QIAquick gel extraction kit (Návod viz níže).
POSTUP PRÁCE – Příprava ligačních směsí
1. Připravte 2 ligační směsi obsahující poměry vektorové a cizorodé DNA 1:1 a 1:3. Každá
směs se připravuje ve finálním objemu 20 ul a obsahuje :
- 100-500 ng vektorové DNA
- 100-500 ng cizorodé DNA
- destilovanou sterilní vodu
2. Směs zahřejeme 5 minut na 45°C - dojde k rozvolnění kohezních konců. Zchladíme na
4°C.
3. Přidáme:
- 2 μl 10x ligačního pufru
- 0,1 Weissovy jednotky T4-DNA-ligázy
4. Po promíchání inkubujte 4 hod při pokojové teplotě.
Ligace 1 (20 l) Ligace 2 (20 l)
Voda
T4 DNA ligázový pufr (10x)
T4 DNA ligáza
Vektor
Inzert