Bi9040 - Biologie kvasinek hustopece_kvasinka_vinna2 22.9.2011 10-11.30hod Dr. Paleček Úvod – historie, význam … 29.9.2011 10-11.30hod Dr. Paleček Metody studia kvasinek 6.10.2011 10-11.30hod Dr. Paleček Genetika a molekulární biologie kvasinek 13.10.2011 10-11.30hod Dr. Paleček Morfologie a buněčný cyklus, párovací proces, HO endonukleasa, lokalizovaná exprese 20.10.2011 10-11.30hod Dr. Paleček Regulace transkripce, 1-2-3 hybridní systémy, reporter systémy 27.10.2011 10-11.30hod Dr. Paleček Organizace chromatinu a oprava DNA 3.11.2011 10-11.30hod prof. Svoboda Sekreční dráhy a endocytóza 10.11.2011 10-11.30hod prof. Svoboda Protoplasty kvasinek jako modelový objekt 17.11.2011 statni svatek 24.11.2011 8-12hod prof. Svoboda+Dr.Paleček - Cvičení k přednášce 1.12.2011 8-12hod prof. Svoboda+Dr.Paleček - Cvičení k přednášce 8.12.2011 10-11.30hod prof. Svoboda Patogenní kvasinky, morfologická charakteristika, medicínské aspekty 15.12.2011 8-12hod Dr. Paleček Zkouška x pozvaný host Po přednášce umístím na IS Informační zdroje Janderová & Bendová: Úvod do biologie kvasinek, nakladatelství Karolinum (1999) … nejnovější články z časopisů Cell, Nature, Science, PNAS … F. Sherman, Getting started with yeast, Methods Enzymol. 350, 3-41 (2002): http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/StartedYeast.html SGD databáze: http://www.yeastgenome.org/ WIKIpedie … Laboratoř S. Forsburg • - savci pili alkoholický nektar miliony let (PNAS, 2008) - Tana pestroocasá pije fermentovaný nektar z květu Bertramovy palmy - dlouhodobá konzumace fermentovaných šťáv vedla k evoluční adaptaci tohoto savce – zvýšená exprese alkoholdehydrogenásy - autoři spekulují o vlivu takovýchto přírodních alkoholických nápojů na evoluci … nastavení hladiny ADH u člověka ;-) - - kvasinky Saccharomyces cerevisiae aj. rostou na substrátech bohatých na cukr - kvasinky fermentují sladký nektar z Bertramovy palmy A B C … trochu historie - přirozeně v prostředí mohou fermentovat sladké šťávy (např. nektar …) - lidé vyráběli nápoje podobné dnešnímu pivu a vínu již před ~9000 roky (chleba před ~4000 lety) - poprvé kvasinky pozoroval A. van Leeuwenhoek v roce 1680 - název Zuckerpilz („cukerná houba“) tj. Saccharomyces od roku 1837 (T. Schwann) - L. Pasteur prokázal aktivní účast při kvašení (publikoval 1866, 1876) - první čisté kultury S. cerevisiae izolovány z piva (E.Ch.Hansen) a z vína (Muller-Thorgau) v 80.letech 19. století (cerevisiae = pivo v latině, pombe = pivo ve swahili) ... M. Rees popsal a pojmenoval S. ellipsoideus (fermentuje ovocné šťávy) - -první systém pro klasifikaci (patogenních) kvasinek, založený na morfologii buněk a několika fyziologických testech (fermentace monosacharidů…) vytvořil A. Guilliermond v roce 1912 - v Československu prof. Kratochvilová … - - nejintenzivněji studovaná eukaryotní buňka (buněčný cyklus …) - S. cerevisiae první kompletně osekvenovaný eukaryontní genom (1996) (S. pombe, 2002; v současnosti osekvenovaných >25 druhů kvasinek) Nobelova cena za výzkum buněčného cyklu (2001 – Nurse, Hartwell, Hunt) Science 272 (1996), p.481 + Nature 458, (2009), p337 Soubor:Ptilocercus lowii.jpg Přirozený výskyt - ve vodě (dle čistoty – moře 10/l, jezera 100/l, odpadní až 108/l; v arktických vodách Leucosporidium, v odpadních vodách Candida parapsilosis, S. exiguus, fekální znečištění indikuje Hansenula anomala, C. albicans, v olejem znečištěných vodách Candida (Yarrowia) lipolytica, C. tropicalis, v planktonu v závislosti na řasách např. Rhodotorula - v půdě (mnohem méně než bakterií, do 15cm hloubky – Schwanniomyces, Lipomyces, Cryptococcus, schopny hydrolyticky štěpit cellobiosu, lignin nebo produkty bakteriálního metabolismu) Conell et al., Microb Ecol 56 (2008) - naproti tomu v Antarktidě jsou dominantní (méně bakterii) - výzkum v letech 2003-4: Izolovány 2x asco- a 16x basidiomyceta (7x nové druhy) • * * * * * * * Přirozený výskyt - na kazících se plodech (na spadlých plodech … schopny hydrolyticky štěpit cellobiosu, lignin nebo produkty bakteriálního metabolismu - zahnívající kaktusy => pektolytické bakterie => kvasinky Pichia cactophila, P. opuntiae => přenos a výživa drosofila) - na listech rostlin, květech (nektar palmy Bertramové … červené kvasinky rodu Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, černá Aureobasidium pullulans,) - přenášeny hmyzem (v zažívacím traktu mušek Drosophila z potravy, izolována Metschnikowia orientalis nalezena v květech a přenášena čmeláky na Cookových ostrovech, Int J Syst and Evol Microbiology, 2006) - img_levedura Kvasinky a savci - Tana pestroocasá pije fermentovaný nektar z květu Bertramovy palmy … i člověku se dostávají kvasinky do trávícího traktu např. při konzumaci burčáku ;-)) - kvasinky tvoří jen malou část stálé mikroflóry ve střevě - méně než 0,1 % mikroflóry •Kvasinky nalezeny ve střevě mouchy Drosophila •Askus chrání spory během průchodu trávicím traktem, ale zároveň dochází k částečnému natrávení enzymy, čímž se usnadňuje kontakt mezi nepříbuznými gametami •Bylo zjištěno, že průchod trávicím traktem 10x zvyšuje frekvenci sexuálního rozmnožování s nepříbuznými gametami •Hypotéza, že hmyz slouží jako vektor umožňující kvasinkám osidlovat nová prostředí, přičemž zvýšená rekombinace zvyšuje šance na přežití a adaptaci na ně -nejčastěji je z gastrointestinálního traktu izolována C. albicans (C. dubliensis) - kůže, ústní dutina, sputum, vaginální sekrety, výtěry zvukovodů, moč, stolice ... - -15 druhů je potenciálními lidskými patogeny (vyvolávají onemocnění u oslabeného organismu – imunosupresiva, cukrovka … významným faktorem virulence je schopnost tvorby biofilmu - antibiotika na eukaryota nezabírají) – více prof. Svoboda - -Kandidózy (C. albicans, dubliniensis, krusei, tropicalis, parapsilosis, glabrata, utilis, lipolytica) -Candida albicans – urogenitální a krevní infekce (vyskytuje se u člověka přirozeně) -Cryptococcus neoformans – 8% AIDS pacientů – plícní onemocnění až do mozku - (přenáší švábi a holubi – kreatinin z trusu používají jako zdroj dusíku) -Malassezia – poruchy pigmentace kůže a lupy tzv. pityriázy (M. furfur, globosa, japonica, obtusa, restricta, yamatoensis, dermatis, slooffiae, sympodialis,.nana, pachydermatis) -3 druhy Trichosporon (kúže) hongo_Malassezia_furfur Malassezia furfur tinea_01 pityriasis versicolor Tinea_Versicolor Prof. A. Svoboda Patogenní kvasinky Průmyslový význam - výroba piva, vína, etanolu a pekařského droždí (S.c.), různé kmeny pro spodní (S. bayanus) a svrchní kvašení, vinařské a lihovarské (hybridní kmeny např. S.c. + S.kudriavzevii) - krmná biomasa (Candida utilis), příprava mléčných výrobků (Candida kefyr, Klyuveromyces lactis), získávání ergosterolu (prekurzor vitaminu D), zdroj komplexu vitamínů skupiny B … - štěpení škrobu amylolytickými enzymy (Saccharmycopsis fibuligera, Schwanniomyces occidentalis) - štěpení dřevní hmoty – štěpí xylozu přímo na etanol za aerobních podmínek(Aureobasidium, Candida utilis, Pachysolen tannophilus, Candida shehatae a Pichia stipitis) - odbourávání ropných produktů (Yarrowia lipolytica), - sorpce těžkých kovů (odstranění znečištění) - - - - - - - exprese proteinů - příprava hepatitis B core antigenu, anti-thrombin proti srážení krve (Pichia pastoris) - - GMO např. příprava bioplastů (monomer; JACS, 2010) pivo Salutil_Probio_10.jpg 19177.jpg Murzyn et al., 2010, FEMS Microbiol Lett. - Saccharomyces boulardii – izolován z čínské švestičky Lyči (1920, Henri Boulard) - používán jako probiotikum při střevních potížích (Enterol, Salutil) - ochrana proti patogenům (Salmonella typhimurium, C. albicans) – modulují imunitní systém, inhibují účinky bakteriálních toxinů a růst hyf … - exprese proteinů - příprava „hepatitis B core“ antigenu, anti-thrombin proti srážení krve (Pichia pastoris) - -Pangamin – kvasinkové lyzáty – vitaminy, nenasycené mastné kyseliny, minerály … - - ImmiFlex – obsahuje beta 1-3,1-6 glukany z buněčných stěn kvasinek S.c. – aktivují imunitní systém (neutrofily) a zvyšují tak obranyschopnost organismu - Význam pro zdraví člověka Výzkum - S. cerevisiae a S.pombe jsou modelovými organismy - jednoduchá eukaryontní buňka (základní procesy jako u vyšších eukar.) - 1. osekvenovaný eukaryontní genom, 1. syntetický eukar. chromosom - buněčný cyklus (sir P. Nurse) - chromosomy a evoluce (např. telomery, duplikace a ztráty chromosomů) - mechanismy opravy poškozené DNA (nádorové syndromy – tabulka) - sekrece, endocytóza, buněčná stěna (prof. A. Svoboda) - Metody využívající kvasinek (např. 2-H, reporterové systémy) - Exprese proteinů (posttranslační modifikace, štěpení …) - Více v dalších přednáškách Srovnání 250 sekvencí lidských genů, jejichž mutace vedou ke vzniku onemocnění – cca 90 genů má S.c. homologů Základní charakteristika kvasinek Základní charakteristika kvasinek -Eukaryota – rostlinný systém – vyšší houby (1500 druhů) – rozdělení dle způsobu pohlavního rozmnožování (asko-, basidio- a deuteromycetes + kvasinkové mikroorganismy) -Lineage› cellular organisms › Eukaryota › Fungi/Metazoa group říše › Fungi › Dikarya oddělení › Ascomycota › Saccharomycotina › Saccharomycetes řád › Saccharomycetales čeleď › Saccharomycetaceae rod › Saccharomyces - -Většinou jednobuněčné organismy (+ hyfy, + kolonie) -Nejčastěji kulaté a oválné (3-15 mikrometrů) -Množí se většinou pučením (+ jedině rod Schizosaccharomces: dělením - podlouhlé) -Zpracovávají zdroje uhlíku kvašením (vyjímky Lipomyces ...) •Potřebují vodné prostředí, kyslík a živiny • •volná voda (nikoli chemicky vázanou) - Vodní aktivita = volně přístupná voda/fyziologicky využitelná voda = available water (aw) •aw = poměr tlaku vodních par nad substrátem (potravinou) a tlaku par destilované vody • –0,95: Pseudomonas, Escherichia,…,většina bakterií –0,85: kvasinky (Candida, Torulopsis, Hansenula) –0,75: většina halofilních mikroorganismů –0,65: xerofilní plísně (Aspergillus) –0,4: potlačení růstu veškeré mikroflóry • •Bakterie vyžadují vyšší hodnoty aw (víc dostupné vody) než kvasinky a plísně (z toho důvodu např. chléb napadají plísně, nikoliv bakterie) •Aktivitu vody lze snížit proslazováním nebo solením (marmelády, nasolování masa … lze takto potlačovat i růst bakterií v kvasinkových izolátech) • •Xerotolerantní kvasinky rostou i za zvýšeného osmotického tlaku – (aw=0.65), rod Zygosaccharomyces (rouxii, bailii, bisporus) – rostou přednostně v potravinách s vysokým obsahem cukru či solí; ostatní (S. pombe, Debaryomyces hensenii, Hansenula anomala) vyšší osmotický tlak tolerují, ale lépe rostou za standardních podmínek (více polyolů, ATPázové pumpy), •Lipomyces mají pouzdro – při zvýšené koncentraci solí upravují jeho složení • •Test: schopnost růstu na 50-70% glukose (většina pouze do 40 %), na 10 % NaCl debaryomyces Debaryomyces hensenii Podmínky růstu - kyslík •- Většina kvasinek je fakultativně anaerobní (vyžadují aspoň stopová množství kyslíku nezbytné pro syntézu některých esenciálních metabolitů – ergosterol, nenasycené mastné kyseliny) -fermentativní typy (S.c., S. p., rod Brettanomyces) - i v aerobních podmínkách fermentují (respirace i na glukoze představuje 10 % uhlíkového metabolismu) -respirativní typy (většina) – převládá energeticky výhodnější respirace nad fermentací •- obligátorně aerobní – nefermentativní typy (nemají alkoholdehydrogenásu - neprodukují ethanol) – rody Lipomyces, Cryptococcus, Saccharomycopsis • •- teploty, při nichž mohou kvasinky růst: • - mezofilní (0 – 48 °C) – většina druhů • - psychrofilní (-2 – 20 °C) – voda, půda v Antarktidě (některé Leucosporidium, Cryptococcus, Candida) • - termofilní (ne méně než 20 °C) – potenciální patogeny (Candida, Cyniclomyces) • •Maximální teploty, které některé kvasinky přežívají, se pohybují kolem 57-59 °C •Laboratorní podmínky 25-30 °C (S.c. i S.p. – rostou i při 15°C a přežívají krátkodobě 50°C), •teplotně senzitivní mutanty (ts, 37°C), chladově sensitivní mutanty (cs, 20°C), živiny •Nejčastějším zdrojem uhlíku a energie jsou mono-, di- a oligosacharidy (jsou schopny hydrolyzovat i polysacharidy jako škrob, xylany či celulozu … nebo methanol (Pichia pastoris), alkany apod.) •Zdrojem dusíku jsou amonné ionty a aminokyseliny • •Laboratorní podmínky: • •YPD – bohaté médium = 10g/l yeast extract, 20g/l pepton, 20g/l dextrose (2%glukosa) •Sabouraudův agar (1892) = 10g/l pepton, 40g/l dextrose (2%glukosa), 20g/l agar, pH 5.6 •Syntetické SD médium = 6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids (aminokyseliny se přidávají dle potřeby), 20g/l dextrose (2% glukosa) •Minimální agarová půda = 5g/l (NH4)2SO4, 1g/l KH2SO4, 0,5g/l MgSO4 .7 H2O, 10g/l glukosa, 1ml/l Wickerhamův roztok, 20g/l agar •Wickerhamův roztok: 0.2mg biotin, 200mg inositol, 20mg riboflavin, 40mg thiamin, 40mg pyridoxin, 20mg kyselina p-aminobenzoová, 40mg kyselina nikotinová, 0,2mg kyselina listová (na 100ml vody) • Morfologie kvasinek -rotační elipsoid, kulaté, protáhlé – rod Dipodascus až 130 mikrometrů -3-15 mikrometrů (bakterie -Haploidní spory vřeckovýtrusných kvasinek vzniklé při sporulaci diploidních buněk (pohlavní rozmnožování) Saccharomyces Schizosaccharomyces Lipomyces Hanensula Metschnikowia Nematospora - hladké kolonie – kulaté a oválné buňky (S.c.) - drsné kolonie – protáhlé buňky (Pichia) - slizovité kolonie – pouzdra (Lipomyces) - obvykle krémová barva – - červený pigment (Rhodotorula, Sporidiobolus) - černý pigment (melanin – Aureobasidium) Např. odlišení C.d. od C.a.: 24h kultivace na Staibově agaru při teplotě 37°C (a) C. dubliniensis (b) C. albicans Kolonie Kvasinkové kolonie spolu „komunikují“ pomocí amoniaku – inhibuje růst sousední kolonie Pálková et al., Nature 390 (1997) kolonie přesměrovává růst sousední kolonie – nekompetují o živiny - Aktivní inhibice růstu sousední kolonie nikoli (pasivní) důsledek spotřebování živiny Komunikace kolonií Biofilm - tvořen matrix s mikrokoloniemi kvasinek, hyfami a pseudohyfami (komplexní struktura) - významně přispívá k rozvoji a odolnosti kandidóz (rezistentní k antimykotickým látkám) Adhesiny - lektinu-podobné adhesiny např. FLO1 (S.c.), EPA (C. glabrata) váží cukry - nezávislé na cukru váží např. peptidy na povrchu hostitelské buňky (C. albicans = ALS2, 3, 6, 7, 9 exprimovány při vaginální infekci zatímco ALS1, 2, 3, 4, 5, 9 exprimovány při orální infekci) Flokulace -reverzibilní schopnost kvasinek shlukovat se, tvořit větší celky (vločky, floky); odpověď na stres -flokulace je významná vlastnost využívaná např. při produkci piva (snižuje náklady na filtraci piva) • Smukalla a kol., 2008, Cell Verstrepen, 2006, Mol. Microbiol -ovlivněno složením média, genetickou výbavou kmene (skupina FLO genů), teplotou, stavbou a morfologií buňky … - Flo1p váže manany na povrchu buněk stejného druhu (S.c.) => agregace - NewFlo váže manosu i glukosu => glukosa v mediu inhibuje agregaci – teprve po přeměně cukrů na etanol se važe na buněčnou stěnu ostatních buněk a dochází k vločkování Prof. A. Svoboda Killer toxiny •- Některé kmeny S.cerevisiae produkují tzv. killer toxiny (proteiny a glykoproteiny sekretované do prostředí), které jsou letální pro citlivé kvasinky i bakterie; ekologická výhoda -Poprvé pozorováno v roce 1963 (Makower a Bevan) kvasinky zabíjí podkladový kmen (K1=laboratorní, K2 a K3=vinařské kvasinky) -Kvasinky ze stejné skupiny se navzájem nezabíjí (různé skupiny ano) -Geny jsou kódovány na dsRNA obalené ve „virus-like particles“ (VLP, připomínají savčí dsRNA viry) – kódují obalové, replikační (ale potřebují buňku k replikaci …), transkripční sekvence a toxin -Samotné VLP nejsou infekční ani toxické (lze je přenést konjugací buněk nebo fůzí protoplastů) -Toxin je sekretován a váže se na buněčné stěny (b-1,6-glukany) - způsobuje perforace/póry v cytoplasmatické membráně – ztráta iontů, potenciálu … buňka hyne - -Kluyveromyces lactis, Pichia membranifaciens – lineární dsDNA (v cytoplasmě, pGK11), bez kapsidy, toxin se váže na chitin (chitinásová aktivita) -Hansenula mrakii … - geny na chromosomech, toxin inhibuje syntézu b-1,3-glukanu (v místě růstu pupenu) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Kontaminace vinných kultur kmenem Brettanomyces bruxellensis může být potlačena P.m. -Význam při ochraně průmyslových kmenů (proti kontaminaci – odolné vůči toxinu a zabijí kontaminanty) -v léčbě (některé S.c. killer kmeny zabíjí kmeny C.a., C. podzolicus zabíjí C.n.) Santos et al., 2009, Microbiology