•Určení (nových) kmenů v nových lokalitách
•
•
•
•
•
•
•
•
•Určení kmene v klinických izolátech (odlišení patogenních kmenů Candida…)
•
•
•
•
•
•
•
•Kontrola čistoty kmene pro biotechnologické procesy (Saccharomyces cerevisiae – pivo)
antarktida_mapa_v 14atlantic_5ffor_5f02 Bromeliaceae03 calbtoes Oral_candida

Zpracování vzorků
•- zpracování vzorků:
• z půdy: promývání v destilované vodě → homogenizace → třepačka …
• klinické vzorky stěrem nebo pomocí lepivé pásky …
•  a pak vysetí na Sabouraudův agar nebo YPD médium → kultivace 3-7 dní při teplotách cca25°C
•
•
•
•
•
•
•
•
-rozdělení dle způsobu dělení a pohlavního rozmnožování
-velikost, tvar buněk i kolonii, schopnost vytvářet hyfy
-biochemické parametry (především schopnost fermentovat různé cukry)
-moderní molekulárně-biologické metody (především PCR)
opsite 220px-PCR_Machine C:\Documents and Settings\Administrator\Plocha\jm1080495001.gif

Morfologické parametry
- rozdělení dle způsobu pohlavního rozmnožování
- asko-vřecko, basidio-stopkovýtrusé a deuteromycetes (neurčené)
- basidiosporogenní produkují ureasu – na močovině s fenolčervení se barví červeně …
- morfologie – tvar, velikost, povrch …, asexuální a sexuální struktury,… teplotní studie….
Campanha et al., 2005, Oral DIseases
C.albicans
C.tropicalis

Biochemické parametry
–- Biochemické testy – založeny na schopnosti utilizace uhlíkatých látek (cukrů), utilizace
dusíkatých látek (hydrolýza močoviny),
–(např. C. dubliniensis není schopna utilizovat D-xylózu, D-trehalózu, methyl-α-D-glukosid –chybí
β-D-glukosidázová aktivita; C. albicans není schopna utilizovat glycerol)
–- chromogení substráty
•
API® / ID 32
API ID 32 C
(Bio-Mérieux)

Molekulární taxonomie
- konvenční taxonomie je problematická :
- morfologie kvasinek není stabilní→ roztěr a nárůst trvá několik dní (prodlužuje se včasná
diagnóza …)
- Většinu fyziologických charakteristik lze zvrátit mutací v jediném genu
WT-S. pombe
S.pombe mutants
- molekulární taxonomie je většinou založena na odlišnosti conzervativních sekvencí jako např. rDNA
- pulsní gelová elektroforéza (PFGE), fluorescence in situ hybridization (FISH)
- Southern blot, PCR (restrikční polymorfismus po PCR nebo před PFGE)
- nejnověji NGS a MALDI-TOF
- obtížná izolace DNA, proteinů … z kvasinek - je třeba nejdříve narušit silnou buněčnou stěnu …
pomocí enzymů nebo mechanicky (poté PCR nebo dále extrahovat DNA)
-

Karyotypizace
•S.c. kmeny mají podobný karyotyp – většinou se liší délkou chromosomu XII (podle počtu rDNA genů)
•Průmyslové kvasinky jsou většinou polyploidní – homologní chromosomy mají odlišné velikosti
•Srovnání kmenů pro fylogenetické účely (intaktní nebo RE naštěpené chromosomy)
•Určení příbuznosti izolátů jednoho druhu pro epidemiologické účely např. kmeny z různých míst od
jednoho pacienta, kmeny od 2 různých pacientů, kmeny od zdravotního personálu a pacientů
6
Přes značnou morfologickou podobnost vykazují kvasinky velké rozdíly v genomu => vhodnější je
analýza genomu (než morfologických znaků)

•Klasická elektroforéza dokáže rozlišit fragmenty pouze do velikosti 40-50kb (větší molekuly se
pohybují stejnou rychlostí nezávisle na velikosti)
•PFGE = pulse field gel electrophoresis (elektroforéza s měnícím se elektrickým polem, při změně
směru elektrického pole trvá větším molekulám DNA déle, než se přeorientují - umožňuje separovat
molekuly velké několik Mb )
•gel obsahuje vzorky DNA uvnitř agarózových bločků (minimalizace náhodných zlomů velkých molekul
DNA)
•
PFGE_animated
PFGE

•1. sada primerů je universální kvasinková (pozitivní kontrola, vyšší proužky) a 2. sada primerů je
druhově specifická (méně konzervovaný úsek DNA) - separace gelovou elektroforézou (barvení ethidium
bromidem, UV transiluminátor)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•po PCR může následovat štěpení restrikční endonukleasou a odlišení druhů na základě odlišné délky
štěpných produktů (tzv. RFLP – restriction fragment length polymorfism)
x
x
x

Nested („zahnízděná“) PCR
•amplifikace probíhá dvoufázově
•v 1. fázi je pomocí jedné sady primerů namnožena delší sekvence nukleové kyseliny
•takto získané amplikony jsou pak přeneseny do jiné amplifikační zkumavky obsahujících druhou
dvojici primerů, specifických k vnitřní oblasti úseku amplikonů
•konzervovaná intergenová oblast rDNA
•detekce gelovou elektroforézou
•eventuálně sekvenace
genomová DNA
1. PCR produkt
2. PCR produkt

•2 sady primerů, intergenová oblast rDNA



Romeo et al., J. Microbiol Met 79 (2009)
Univerzální primer (konzervativní oblast 5.8S rDNA)
Candida glabrata
397bp
Candida nivariensis
293bp
Candida bracarensis
223bp
Multiplex PCR

Sekvenování
800px-Sanger_sequencing_read_display
Různě fluorescenčně značené ddNTP (zablokují PCR reakci)
Produkty rozděleny kapilární elektroforézou dle délky

Nová generace sekvenování
Picture12-3
Technologie 454 od firmy Roche
Picture13-1
- 300 000 jamek každá s jednou kuličkou obsahující jeden typ ssDNA
- jednokrokové PCR za přítomnosti pouze jednoho typu nukleotidu (pokud dojde k zainkorporování pak
se emituje světlo, které je detegováno – intenzita přímo úměrná počtu nukleotidů)

1.Destička se „fotí“ v čase po každém kroku
T
A
C
G
T
2.Snímek každé jamky se skládá do sekvence
flowgram_1790_203
3.Síla signálu odpovídá počtu zainkorporovaných nukleotidů
A C G T
AGCTATG…

UPDATE CURRENT FLOW ORDER

Studie populací S. cerevisiae a S. paradoxus
•Sekvenace (+ hybridizace  na čipech) > 100 kmenů z různých koutů světa
•S. paradoxus – linie izolované podle lokalit
•
•
•
•
•
•S.cerevisiae - 3-4 původní linie,
• které se díky člověku křížily …
•
Nature 458, (2009), p337

•hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým
analyzátorem (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry–
MALDI-TOF)
•Umožňuje odpaření a ionizaci netěkavých biologických vzorků z pevné fáze přímo do plynné
•
•Vzorek   je   smíchán   s   tzv.   matricí
• (v molárním poměru řádově 1:10-4)
•
•Směs se nanese na speciální kovovou
• destičku a nechá zaschnout
•
•Destička    se    vloží    do    iontového
• zdroje a ve vakuu je ozářena pulsním
• laserem (UV)
•
•Energii laserového pulsu absorbuje matrice a předá ji molekulám analytu – odpaří se
•
•
•
C:\Users\Andrej\Desktop\maldi1.jpg
MALDI-TOF

•
•
•
schema_maldi-tof-ms.gif
ion vstupuje do vakua v trubici detektoru - z jeho pohybu vakuovaným prostorem lze vypočítat poměr
jeho hmotnosti a náboje (z doby letu částice)

•MALDI-TOF hmotnostní spektrum je zobrazením četnosti ionizovatelných částic buněčného proteomu
•
•Charakter spektra závisí  na krystalizaci a ionizačních vlastnostech vzorku à výška píku je rovna
relativní koncentraci proteinu v místě  ionizace
•
•Při srovnávání spekter druhů uvnitř rodu se hledají rodově charakteristické signály píků
•
•Identifikace  na   úroveň  kmenů možná díky detekci charakteristických proteinů a peptidů
•
Anal Bioanal Chem 392, (2008), p. 439

Práce s kvasinkami v laboratoři
HU
2,5mM
5mM
7,5mM
WT
ředění
•rychle se množící EUKARYOTNÍ buňky (90 min/dělení, 25-30°C)
•vytváří kolonie na „jednoduchých“ agarových plotnách (např. YPD)
•na plotně narostou za 2-3 dny a ve YPD médiu přes noc
•YPD – bohaté médium = 10g/l yeast extract, 20g/l pepton, 20g/l dextrose (2%glukosa)
•SD – minimální (syntetické) médium = 6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids - aminokyseliny se
přidávají dle selekce, 20g/l dextrose (2% glukosa)
•lze používat klasické mikrobiologické metody (roztíraní, kapkování, otiskování ploten)
•do ploten je možné přidávat testovací látky (např. HU, MMS …)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•na plotnách lze kvasinky uchovávat 1-3 měsíce (v lednici)
•pro dlouhodobé uchovávání se narostlé buňky (suspenze) smíchají s glycerolem (>15%), zamrazí se v
dusíku a uloží na -80°C
YPD

•
•techniky barvení na fixovaných buňkách (cytoskelet, stěna ...) nebo
•in vivo pomocí GFP-značek
•
•
•
•
•
•
•
•mutagenezí lze připravovat teplotně senzitivní mutanty (ts, 37°C) a chladově sensitivní mutanty
(cs, 20°C) – např. zastavení buněčného cyklu při 37°C
•lze připravovat buněčné extrakty pro analýzu DNA, proteinů … (je třeba narušit silnou buněčnou
stěnu pomocí enzymů nebo mechanicky)
•do buněk lze transformovat DNA (pomocí octanu litného a tepelného šoku nebo elektroporace)
•lineární DNA se integruje do genomu díky vysoké frekvenci homologní rekombinace (takto lze
připravovat deleční a mutantní kmeny)
•plasmidová DNA se replikuje (centromerické a multicopy plasmidy – DNA knihovny)
•

•stabilní haploidní i diploidní formy (S. cerevisiae)
•haploidní buňky lze křížit na diploidní (heterozygotní mutanty)
•diploidní buňky lze sporulovat a využít pro genetickou analýzu (tetrádová analýza)
•
•
•
•
-(rostou) většinou v G1 fázi (zatímco pombe je v G2 fázi)
-Genom 12 Mbp na 16-ti chromosomech
-Krátké centromery a ARS (100bp)
-Kóduje přes 6 000 genů
-120 kopii rRNA, 262 tRNA
-Geny reprezentují 75% celkové sekvence (kompaktní)
-<5% genů obsahuje introny (0.5% genomu), 3% transposony (46% u člověka)
-
-Výhody pro práci s S.c.
–knihovny s genomovou DNA (ne cDNA)
–Kompletně osekvenovaný genom (genomové aplikace)
–EuroFan projekt – delece všech S.c. genů (+GFP, +2-hybrid)
–Mikročipy - expresní profily za různých podmínek
–Řada životních dějů má analogii v procesech v savčích buňkách (lidské geny testovány v kvasinkách
- nemoci, metabolismus, regulační mechanismy)
Saccharomyces cerevisiae

Laboratorní S.c. kmeny
S288C – 1. osekvenovaný kmen
Genotype: MATα gal2 mal mel flo1 flo8-1 hap1
Notes: Strain used in the systematic sequencing project, the sequence stored in SGD. S288C does not
form pseudohyphae. In addition, since it has a mutated copy of HAP1, it is not a good strain for
mitochondrial studies. S288C strains are gal2- and they do not use galactose anaerobically.
References: Mortimer and Johnston (1986) Genetics 113:35-43.
Sources: ATCC:204508
W303 – nejčastěji používaný laboratorní kmen
Genotype: MATa/MATα leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15
Notes: W303 also contains a bud4 mutation that causes haploids to bud with a mixture of axial and
bipolar budding patterns. In addition, the original W303 strain contains the rad5-535 allele.
References: W303 constructed by Rodney Rothstein (see detailed notes from RR).
Sources: Biosystems:YSC1058
Dvojhybridní systém:

chrIII
Chromosom III (S.c.)
CEN, ARS, TEL, Ty1-5
obsahuje MAT lokus
Nomenklatura pro S.c.:
YCRXXw:
Y=yeast
C= 3. chromosom
R= pravé raménko
XX=pořadové číslo
w/c=Watson/Crick
LEU2 – gen
Leu2p - protein
leu2-D1 – delece
leu2-1 – mutace
LEU2::HIS3 – inzerce HIS3 genu v lokusu LEU2
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5213-5218.




Allele
Reverts?
Notes
Molecular descriptiona
Reference
ade2-101
yes
ochre mutation, red colonies
G to T transversion at nucleotide 190, changing amino acid 64 from a Glu to a Stop
Gai and Voytas, 2005
can1-100
yes
ochre mutation
AAA-to-TAA ochre nonsense change at codon 47
Rodney Rothstein, Personal communication to SGD.
his3delta200
no
Cold sensitive; high frequency of petite formation, especially during transformation.
Note that this deletion damages the PET56 promoter. See Zhang et al., (2003) for a discussion of
this issue.
1 kb deletion, (-205 to 835)
Struhl 1985; Fasullo and Davis 1988; Siram et al. YGM RNA processing mtg 1993
leu2-3,112
no
double mutant
GTC-to-GTT silent change at codon 56,
GTT-to-GCT missene change at codon 69,
G insertion at nucleotide 249,
G insertion at nucleotide 792,
GTT-to-GTC silent change at codon 299,
GAC-to-AAC missense change at codon 300.
Hinnen et al. 1978;
Gaber and Culbertson 1982;
Meira LB et al., 1995;
Rodney Rothstein, Personal communication to SGD.
trp1-1
yes
amber mutation
GAG-to-TAG amber nonsense change at codon 83
McDonald, et al. 1997
ura3-52
no
-
Ty1 insertion (transcribing left to right) at pos. 121
Rose and Winston 1984

Auxotrofie
marker
aktivita
auxotrofie
pozn.
ADE2
fosforibosylamino-imidazole-karboxylasa
Ade-
vyžaduje adenin k růstu, červené kolonie (metabolit)
HIS3
 Imidazoleglycerol-fosfat dehydratasa
His-
vyžaduje histidin k růstu, inhibitor 3-aminotriazol (3-AT)
LEU2

Leu-
vyžaduje leucin k růstu
LYS2
a-aminoadipate reduktasa
Lys-
vyžaduje lysin k růstu, inhibitor a-aminoadipic acid (aAA)
TRP1

Trp-
vyžaduje tryptofan k růstu
URA3
orotidine-5’fosfat dekarboxylasa
Ura-
vyžaduje uracil k růstu, * 5-fluoro-orotic acid (FOA)
*FOA je přeměňován Ura3p dekarboxylázou na toxický 5-fluorouracil. URA3+ buňky nerostou, zatímco
ura3- buňky jsou resistentní (další způsob selekce – zpětná)

G418 (kanMX) – obdoba anti-bakteriálního antibiotika kanamycinu, hygromycin (hyg),
clonnat/noursethecin (nat) - lze použít i na S.pombe a P.pastoris

- podobné geny jako S. cerevisiae (stejná nomenklatura, schopnost komplmentace)
- genom na 4 chromosomech
- metylotrofní kvasinka (schopná růst na metanolu jako jediném zdroji uhlíku)
- Metanol je odbouráván v 1.kroku alkohol oxidázou (AOX1)
- PAOX1 je silný promotor (5% celkové RNA) – represe glukozou a indukce metanolem
- exprese proteinů je 10-100x vyšší (až 30% celkového proteinu)
- vytváří kratší glyko řetězce (8-14 manosových zbytků – podobné vyšším eukarytům; S.c. 50-150
manosových zbytků - více imunogenní)
        Schizosaccharomyces pombe
- většinou haploidní buňky
- pouze 3 kondenzované chromozomy (13 Mbp)
- velké repetitivní centromery (40-100kb) a 1kb počátky replikace
- má geny pro heterochromatin (S.c. nemá)
- asi 4800 kodujících genů (nejmeně u eukaryot)
- z nichž 43% má introny
-
http://www.sanger.ac.uk/modelorgs/yeast.shtml
Pichia pastoris

Laboratorní kmen
Pichia pastoris
GS1115 – expresní kmen
Genotype: his4
Notes: Invitrogen kit
501 – nejčastěji používaný laboratorní kmen
Genotype: h- leu1-32, ura4-D18 ade6-704
Notes: LEU2 gen z S.c. komplementuje leu1-32 mutaci, URA3 gen z S.c. slabě komplementuje ura4
deleci, kolonie ade6-704 mutant jsou červené (jako ade2 S.c. mutanty)
Laboratorní kmen
Schizosaccharomyces pombe