Regulace transkripce v haploidních buňkách
a1, a2 + a1, a2 kódují transkripční faktory, které ovlivňují transkripci 3 skupin genů
a-spec.= MFA1,2 (a-feromon), STE2 (a-receptor), STE6, 14 (úprava a sekrece feromonu)
a-spec.= MFa1,2 (a-feromon), STE3 (a-receptor), STE13, KEX2 (proteasy)
haploid spec.= STE4,18 (podjednotky G-proteinu), RME1 (inhibitor meiosy)
aSG      ON
aSG              OFF
haploid SG    ON
MAT lokus
Typ buňky
Geny kontrolované MAT lokusem
a haploid
a1, a2
a haploid
a1, a2
aSG      OFF
aSG              ON
haploid SG    ON
a2
a1
diploid
a1, a2
a1, a2
aSG      OFF
aSG              OFF
haploid SG    OFF
a2
a1
a2
a1

a haploid
a1, a2
aSG      OFF
aSG              ON
haploid SG    ON
a2
a1
Struktura promotorů
Kvasinkové promotory se liší od bakteriálních a vyšších eukaryot (kvasinky netranskribují z
takových promotorů)
-Většina míst pro iniciaci transkripce obsahuje TC(G/A)A a PuPuPyPuPu (specifické pro kvasinky)
- TATA box (TATAT/AAT/A) je 60-120bp od iniciačního místa (podobné Pribnowovu boxu u bakterii)
- UAS (upstream activating sequences) a URS (upstream repressing sequences)
- DAS (downstream activating sequences – přímo v sekvenci genu)
Represor
na URS
Aktivátor
na UAS
konstitutivní

GALpath
- Pouze GAL5 gen je konstitutivně exprimován (potřebný pro metabolismus glukózy)
- všechny ostatní jsou indukovány růstem na galaktóze a reprimovány glukozou
- GAL1, GAL7 a GAL10 geny jsou v klastru na chromosomu 2
- GAL4 gen kóduje transkripční faktor (aktivátor), který se váže na UAS těchto genů
Regulace metabolické dráhy galaktózy
gal mutanty …

- GAL1, GAL7 a GAL10 geny jsou v klastru na chromosomu 2
- GAL4 gen kóduje transkripční faktor (aktivátor), který se váže na UAS těchto genů

- Gal80p se váže na Gal4p a reprimuje/inhibuje transkripci
- Gal3p přemění galaktozu na induktor (váže se na Gal80p a blokuje vazbu na Gal4p)
- GAL1 promotor je rychle indukovaný a velmi silný – 1000x se zvýší mRNA (až 1%)
- používá se pro overexprese/nadprodukce proteinů
Uetz and Finley, 2005
Regulace transkripce GAL genů

Transkripční aktivátor Gal4p
Transkripční komplex
CO Biotech (1995) p. 59

>

Vznik 1-hybridních systémů
- Takto funguje např. i FASAY (Functional Analysis of Separated Alleles in Yeast) pro testování
mutantních p53 (transkripční faktor)
Různé transkripční faktory mají podobné domény a lze je kombinovat …
Lze hledat DNA-vazebné proteiny pro danou UAS sekvenci (AD-hybridní knihovny)

FASAY (Functional Analysis of Separated Alleles in Yeast)
Oncology Reports (2008) p. 773
wt p53
mut p53 (duplikace 30bp)
kvasinka opravila
Ade2 reporter gen
UAS
transkripce
p53
wt
mut p53
Ade2 reporter gen
UAS
p53
mut

                                         luciferáza
D-luciferin + O2                               oxyluciferin + světlo
Toxikologické aplikace

2-hybridní systém
His3
His3
His3

MaV203 kmen navíc obsahuje URA3 reporter gen – lze tedy selektovat na uracilovou auxotrofii +
reversní systém tj. mutanty disruptující interakce (na FOA)
plasmid
(TRP1)
plasmid
(LEU2)

Nature (2000) p. 623
Y
X
DBD
AD
Mat a buňky
8x12 jamek
(96 na misku)
Všechny ORF
Mat a buňky
Y
X
Reporter gen
GAL1 UAS
transkripce
DBD
AD
Kvasinkový „INTERACTOME“

Protein „networks“
RNA sestřih
Buněčný cyklus

Reversní systém (Y2H)
-Při použití URA3 reportéru lze použít toxickou 5-fluoro-orotátovou kyselinu (5-FOA) k negativní
selekci tj. interakce povede k záhubě kvasinek, zatímco mutanty neschopné interakce na FOA plotnách
porostou (mutanty nebo syntetické látky)
TIBTECH (1999) p. 374

Split-hybrid systém
page4-split-hybrid
PNAS (1996) p. 13896
represor
bez represoru

Y
X
Interakce vyžadující post-translační modifikace
Reporter gen
minimální
GAL1 UAS
transkripce
DBD
AD
enzym
Nat Biotech (2004) p. 888
- Některé protein-proteinové interakce jsou závislé na post-translačních modifikacích
- v buňce jsou přítomny např. acetylasy i deacetylasy, ale nemusí docházet k acetylaci hybridního
proteinu – řešením je „připojení“ příslušného enzymu k hybridu
- konstitutivní modifikace a každý enzym ve stechiometrickém poměru k substrátu (nejsou nutné
kofaktory regulující interakci/modifikaci)

Klasický dvojhybridní systém
Trojhybridní systém
– heterotrimerní proteinové komplexy
- posttranslační modifikace
Trojhybridní systém
- proteinový inhibitor interakce
Trojhybridní systém
– RNA interakce
- ligand/receptor

Analýza vazby protein-RNA (Y3H)
PNAS (1996) p. 8496
FEBS letters (2004) p. 7

Vazba ligand-receptor (Y3H)
FK506
PNAS (1996) p. 12817
dexamethasone
glucocorticoid receptor - FKBP12

PNAS (1997) p. 13396
nano-kapky
FK506 připojen na kuličky přes fotolabilní raménko - po uvolnění začínají kvasinky růst
Inhibitory proteinových interakcí
A
B
A-B

Dihydrofolát reduktása/methotrexát
Aktivní DHFR je vytvořena propojením dvou separovaných částí enzymu – odbourává pro kvasinky
toxický methotrexát
Science (2008) p. 1465

CytoTrap 2-hybridní systém
Kvasinkový cdc25-2 ts mutant - hSOS (guanine exchange factor) aktivuje RAS pokud je ukotven na
membránu v jeho blízkosti
- jeden partner je myristylován a ukotven na membránu a druhý (interakční) partner je fuzován k
hSOS
Cell growth
Cur Biol (1998) p. 1121

•
PNAS (1994) p. 10340
ubiquitin
reporter
Western blot analysa