ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ
REAL-TIME PCR
2. Kvantifikační strategie
Repeatability (Opakovatelnost)
Intra-assay variabilita (stejná analýza v jedné laboratoři)
Reproducibility (Reproducibilita)
Inter-assay variabilita (stejná analýza v různých laboratořích)
Kvantifikační strategie
Precision (Přesnost)
Shoda mezi experimenty („jak přesně pipetujeme“)
Přesná kvantifikace závisí na:
Accuracy (Správnost)
Shoda mezi experimentálně zjištěnou hodnotou a realitou
Kvantifikační strategie Faktory ovlivňující PCR
Templát – Izolace RNA
- Volba zdroje (charakter tkáně, biopsie, mikrodisekce…)
- Integrita (RNA Integrity Number – RIN) výpočet na základě 28S a 18S rRNA
- Čistota (A260/280; A260/230), přítomnost PCR inhibitorů
- Přesné určení koncentrace RNA
- Celková RNA nebo mRNA?
- Vhodnost metody, automatizace, výtěžek…
RIN
Reverzní transkripce
- Významný zdroj variability v qRT-PCR
- Metoda izolace RNA může významně ovlivnit proces reverzní transkripce
- Volba primerů, enzymu, teplotního profilu
- One step vs. Two step PCR
- Výtěžek cDNA
- sekvence směrem 5’konci signifikantně nižší výtěžek než 3’
- RNáza H
Kvantifikační strategie
Kvantifikační strategie
End-point vs. Real-Time PCR
– Vztah mezi vstupním množstvím templátu a výsledným množstvím amplikonu je úměrný pouze
v exponenciální fázi reakce
– Klasická PCR proto musí být zastavena ještě před dosažením plateau fáze
– Intra-assay variabilita klasické PCR (30-40%); Inter-assay variabilita (50-70%)
Plateau
fáze
Exponenciální amplifikace
pod úrovní pozadí -
background
Exponenciální lineární
fáze
end point
real-time
Kvantifikační strategie
Zpracování dat A data přímo z přístroje
B vyhlazení dat
C normalizace pozadí (na základě nespecifické fluorescence)
D normalizace amplitudy signálu (na základě plateau)
stanovení Ct
Množství polymerázy
Koncentrace primerů
Tvar mikrozkumavek
100%
Účinnost PCR je 100% jen výjimečně, dokonce i v případě opakovaných
PCR identických templátů
Kvantifikační strategie
Účinnost PCR (Efficiency)
Y=N 2n
Y=N (1+E%)n
PCR efficiency
PCR efficiency
10-fold or 2-fold dilution
PCR efficiency
• Exponential amplification= 10(-1/slope)
• Efficiency= 10(-1/slope)-1
• If slope -3.32, then PCR 100% efficient
• If 100% efficient- 10x dilution gives dCt 3.2
– Every 3.2 cycles amount of amplification is 10 fold higher
• Efficiency between 90-100% OK
PCR efficiency
• Length of amplicon
• GC content of amplicon
• Secondary structures in primers, probes, amplicon
• Concentration of reagents
PCR efficiency
• R2- how well data points lie on line (linearity of PCR
reaction)
• R2<0.95 – not pipetted correctly or inhibitors
• Sensitivity- the lower Ct, the better
• Reproducibility- by replicates (not more than 0.5 Ct
difference)
GAPDH
Gen 3
Gen 1
Gen 2
Výpočet účinnosti PCR – externí
standardy
Kvantifikační strategie
k E %
Gen 1 -3,3848 1,9744 97,44
Gen 2 -3,8847 1,8089 80,89
Gen 3 -3,560 1,9094 90,94
Reference gene
(GAPDH)
-3,4594 1,9475 94,75
Ideálně -3,32 2 100
R2 ≥ 0,985
Účinnost PCR
Kvantifikační strategie
Otázka:
Provádíte PCR alikvotu templátové DNA obsahujícího 3×105 kopií. V předchozích experimentech
jste určili efektivitu reakce 85%. Kolik cyklů musíte provést, abyste dosáhli výsledného počtu kopií
2 ×1010 ?
n
K amplifikaci z 3×105 na 2 ×1010 s účinností 85% je nutných minimálně 18 cyklů.
Odpověď:
Y= N(1+E)n
Y = 2 ×1010
N = 3×105
E = 0,85
n = ?
2 ×1010 = 3×105 (1+0,85)
2 ×1010
3 ×105
=log log (1+0,85)n ×
2 ×1010
3 ×105
=log log (1+0,85)
n =
0,67 ×105log
n ×
log 1,85
n = 18,5
Kvantifikační strategie
1. Absolutní kvantifikace
• srovnání Ct jednotlivých vzorků s externím standardem (kalibrační křivkou)
• Exaktní výsledek – zvolená jednotka (např. počet kopií/ng RNA/ml krve/
genom/buňku/hmotnost tkáně… atd.)
• Vysoká reprodukovatelnost, specifita a přesnost kalibračních křivek
• Velký dynamický rozsah – 101-1010 molekul templátu
• Validace
• Volba externího standardu (recDNA, gDNA, RT-PCR produkt, recRNA, syntetické
oligonukleotidy…)
• Reprodukovatelnost výsledků
Kvantifikační strategie
Externí standardy
DNA
− Plazmidová DNA, genomová DNA, cDNA, syntetické oligonukleotidy
− Velmi stabilní, odolné vůči náhodnému štěpení
− Úseky DNA cca 2kb mají podobné vlastnosti jako mRNA/cDNA
− Reprodukovatelné výsledky
− Snadné stanovení koncentrace
− Kalibrační křivky založené na DNA nereflektují RT krok
− Externí standardy nezohledňují přítomnost PCR inhibitorů
Výsledek absolutní kvantifikace závisí na
1.Volbě standardu
2.Good laboboratory practice
Kvantifikační strategie
Externí standardy
Kvantifikační strategie
RNA
• RecRNA (rekombinantní RNA)
– syntetizována přímo nebo in vitro z plazmidové DNA, obsahující klonovaný RTPCR
fragment
• Reverzní transkripce
- Odlišná kinetika reakce než u nativní RNA
- Neodráží zastoupení jednotlivých RNA frakcí (rRNA 80%, tRNA 10-15% a další)
• Externí standardy nezohledňují přítomnost PCR inhibitorů
• Stabilita a citlivost k nukleázám
• Komerčně dodávaná celková RNA nebo její frakce (polyA, tRNA) jako tzv.
background RNA – zvýšení účinnosti RT RecRNA
Externí standardy
Kvantifikační strategie
Je nutné vytvářet pokaždé novou kalibrační křivku? Jaká je její reproducibilita?
Předpokládáme stejnou instrumentaci, reagencie i templát (opakujeme stejnou kalibrační křivku)
variabilita
2-3% směrnice (k)
10% posun (q)
- Některé přístroje (např. Roche Lightcycler) umožňují ukládání standardních křivek a jejich
kalibraci (korekce q) prostřednictvím jediného datového budu v každé analýze (za předpokladu
konzistentního designu analýzy)
y= k x + q
α
Kvantifikační strategie
Efekt počátečního počtu kopií
Odhady množství templátu nad 1000 kopií jsou relativně přesné (chyba 1%)
Ale - malý vstupní počet templátových molekul – chyba narůstá
Např. účinnost PCR 80% → v každém cyklu pravděpodobnost 20%, že nedojde ke
zdvojnásobení počtu molekul
Monte Carlo effect
závisí na množství templátu – čím je menší množství
templátu, tím je i menší pravděpodobnost, že množství
amplikonu bude odrážet skutečné množství templátu (nárůst
variability)
Monte Carlo effect
100ng 10ng 1ng 0,1ng 0,01ng 0,001ng
Přesto, lze úspěšně kvantifikovat i extrémně malá
množství templátu:
Stanovení 10 kopií genomu viru hepatitidy C v plazmě
Intra-assay variabilita (CV) 3,1%
Inter-assay CV 4,4% (4,15% CV pro 100000 kopií)
2. Relativní kvantifikace
• Nevyžaduje externí standardy
• Srovnání Ct jednotlivých vzorků (genů) (např. u pacienta po léčbě) s expresí
referenčního genu (housekeeping gene) a vůči biologické kontrole
• (např. pacient před léčbou, zdravý člověk…)
• Kontrola = kalibrátor
• Určení poměru exprese
- ∆∆Ct
- Korekce účinnosti PCR
- Hodnocení skupin vzorků – software REST/REST XL
Kvantifikační strategie
2. Relativní kvantifikace ∆∆Ct
Kvantifikační strategie
Bez zahrnutí efektivity jednotlivých reakcí
Předpokládáme 100%
R= 2-[∆Ct sample-∆Ct control]
R=2-∆∆Ct
A
A
B
B
c-fos
GAPDH
vzorek c-fos GAPDH ∆Ct ∆∆Ct R
A 22,00 18,18 3,82 0 1
B 22,34 15,76 6,58 2,76 1,15
Kvantifikační strategie
Korekce relativní kvantifikace zahrnující účinnost PCR
Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen(kontrola-vzorek)
(Ereferenční gen)∆Ct referenční gen (kontrola-vzorek)
Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen (PRŮMĚR kontrola - PRŮMĚR vzorek)
(Ereferenční gen)∆Ct referenční gen (PRŮMĚR kontrola - PRŮMĚR vzorek)
Ratio = (Ereferenční gen) Ct vzorek (Ereferenční gen) Ct kalibrátor
(Ecílový gen) Ct vzorek (Ecílový gen) Ct kalibrátor
÷
Účinnost PCR
I malý rozdíl v účinnosti PCR mezi stanovovaným genem a referenční kontrolou může
dramaticky změnit výsledný poměr
Např. rozdíl v účinnosti (∆E) = 3%
E cílový gen > E referenční gen po 25 cyklech poměr 47%
E referenční gen > Ecílový gen po 25 cyklech poměr 209%
E cílový gen > E referenční gen po 25 cyklech poměr 28%
E referenční gen > Ecílový gen po 25 cyklech poměr 338%
E cílový gen > E referenční gen po 25 cyklech poměr 7,2%
E referenční gen > Ecílový gen po 25 cyklech poměr 1083%
Kvantifikační strategie
= 5%
= 10%
Experiment: Srovnání exprese klinicky významného genu (YFG) u
pacientů a zdravých dobrovolníků. Normalizace vůči GAPDH.
Pacienti: Ct (YFG) 32; Ct (GAPDH) 26
Kontrola: Ct (YFG) 35; Ct (GAPDH) 27
Jak se liší exprese YFG u pacientů a zdravých dobrovolníků?
Pacienti: dCt=32-26 = 6
Kontrola: dCt=35-27 = 8
ddCt: 6-8 = -2
Poměr exprese: 2-ddCt = 4
Experiment: Srovnání exprese klinicky významného genu (YFG) u
pacientů a zdravých dobrovolníků. Normalizace vůči GAPDH.
Pacienti: Ct (YFG) 32; Ct (GAPDH) 26
Kontrola: Ct (YFG) 35; Ct (GAPDH) 27
Efektivita PCR (YFG) 80%; (GAPDH) 90%
Jak se liší exprese YFG u pacientů a zdravých dobrovolníků?
Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen(kontrola-vzorek)
(Ereferenční gen)∆Ct referenční gen (kontrola-vzorek)
Ratio = 1,83 = 5,832 = 3,07
1,91 1,9
Experiment: Srovnání exprese klinicky významného genu (YFG) u
pacientů a zdravých dobrovolníků. Normalizace vůči GAPDH.
Pacienti: Ct (YFG) 32; Ct (GAPDH) 26
Kontrola: Ct (YFG) 35; Ct (GAPDH) 27
Efektivita PCR (YFG) 60%; (GAPDH) 105%
Jak se liší exprese YFG u pacientů a zdravých dobrovolníků?
Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen(kontrola-vzorek)
(Ereferenční gen)∆Ct referenční gen (kontrola-vzorek)
Ratio = 1,63 = 4,096 = 1,998
2,051 2,05
!
Kvantifikační strategie
Normalizace v relativní kvantifikaci
Sample-to-sample variation
Run-to-run variation
Korekce variability mezi jednotlivými vzorky, způsobené
• Charakterem vzorků
• Integritou RNA
• Efektivitou RT
• Pipetovací chybou
Normalizace vůči
• Neregulovanému endogennímu referenčnímu genu
• Celkové buněčné RNA/DNA
Kvantifikační strategie
Referenční geny
Kvantifikační strategie
GAPDH
Albumin
Aktin
Histon H3
Tubulin
Cyklofilin
Mikroglobuliny (B2M)
Ubiquitin
18SrRNA
28SrRNA
GAPDH je regulovaná za nejrůznějších experimentálních i
fyziologických podmínek
Experimentální
podmínky
Tkáň Extracelulární
faktory
Onemocnění
Věk
Apoptóza
Buněčný cyklus
Vývojové stádium
Hladovění
Hypoxie
Oxidativní stres
Těhotenství
Sérum
Leukocyty
Erytrocyty
Střevní biopsie
Endothelie
T-lymfocyty
Thyrocyty
UV
IL2
NO
TPA
Dexamethason
Cholinergní agonisté
Kreatin
Inzulín
Retinová kyselina
Růstový hormon
Vitamin D
MnII+
Karcinom
- prsu
- cervixu
- kolorekta
- plic
- jater
- prostaty
- slinivky
Neurodegenerativní
onemocnění
Kvantifikační strategie
Referenční geny
Programy geNorm a BestKeeper (freeware)
Určení expresních profilů více housekepingových genů,
zhodnocení jejich variability (pairwise correlation),
geometrický průměr více opakování
Vyhodnocení nejstabilnějšího housekeepingového genu za definovaných podmínek.
Jak na to?
Tkáňové kultury
– normalizace vůči počtu buněk, referenčnímu genu, RNA…
– replikáty
Mononukleární krevní buňky
– heterogenní populace
– FACS – normalizace vůči počtu buněk definovaného typu
– kvantifikace vůči expresi genu pro příslušný CD (CD-19 B-lymf.)
– totální RNA
Kvantifikační strategie
Jak na to?
Biopsie solidních tkání
- Nádorová tkáň
- Heterogenita
- Otázkou je, zda-li je vůbec objektivně možné relativně kvantifikovat klasické biopsie
(problémy s referenčním genem a jeho expresí v daném místě, počtem buněk…)
Laser Capture Microdissection
- Normalizace exprese vůči referenčnímu genu
- Výhodou je histologická informace a znalost počtu buněk
Celková RNA
- Nutné přesné určení koncentrace RNA
- Nereflektuje RT a PCR krok
rRNA
- Jiný charakter exprese, jiné polymerázy, atd.
- Její hladina je ale ovlivněna méně než v případě mRNA
(s výjimkou krevních buněk)
- Otázka volby subpopulace (28S, 18SrRNA)
D'Souza et al. BMC Neuroscience 2008 9:66 doi:10.1186/1471-2202-9-66
Shrnutí
Kvantifikační strategie
Umíte odpovědět na následující otázky?
– design experimentu, např. je vzorek tkáně reprezentativní? Jaké
biologické kontrolní vzorky musím použít?
– volba metody, jaký templát bude vstupovat do mých reakcí?
mám použít pouze poly-A RNA nebo celkovou RNA? Má
dostatečnou kvalitu? One step nebo two step PCR?
– s jakou účinností běží moje PCR?
– absolutní nebo relativní kvantifikace?
– je zvolený housekeepingový gen vhodný?
– proběhla má real-time PCR správně? Jsou Ct stanoveny správně?