> EVROPSKÁ UNIE MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OPVzděláviní IMI nimio i tno i vu ůwjlů i vi, ukvzdělávaní ^."^■^-^ MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY ptokonkurenceschopnost MNA** INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky UVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR V. Návrh primem a sond Design primem a sond Hybridizace • Úspěšný annealing sondy a primerů je kritický předpoklad úspěšné PCR - Sekvence - Koncentrace solí - Tvorba heterodimerických stabilních struktur - Párování bazí - nejen Watson a Crick - Sekundární struktura - Teplota tání DNA Tm Design primem a sond Melting temperature Tm •jeden z nejduležitějších parametru, determinující annealingovou teplotu • Tm - teplota, při které je 50% daného oligonukleotidu denaturováno • „cooperativní melting" - usnadněná denaturace po disociaci prvního páru bazí • Sekvence: A=T < G=C • Rychlost renaturace (a tedy i Tm) přímo úměrná délce řetězce a jeho koncentraci a nepřímo úměrná komplexitě molekuly (struktura) • Elektrostatické interakce mezi fosfátovýnmi molekulami • kationty maskují + náboje fosfátů - vyšší iontová síla vede k vyšší Tm Oligonukleotidy kratší než 20bp 100 Tm = 2 x (A+T) + 4x (G+C) % ss Iontová síla, %GC a délka řetězce (N) 50 Tm=81,5+16,6 (logl 0[Na+]+0,41 (%GC)-(625/N) Web-based kalkulátory http://inSiliCO.ehU.eS/tm.php Tm Temperature Design primem a sond Melting temperature Tm 100 í 80 o o c 60 y) o % o + 40 C C n! á 20 60 Trn lower in lower salt concentration / Tm higher in higher salt concentration 70 80 90 100 110 GCTATTCAACTGAAGAGGGCACAGC CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG Tm - 25' >T. m GCTATTCAACTGAAGAGGGCACAGC CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG T* - 25' >T m GCTAT TCAACTGAAGAGGGCACAGC CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG GCTATTCAACTG AGAGGGCACAGC CGATAAGTTGAC_TCTCCCGTGTCG T note: is 4 lower than Tm {In general, there is a 1° drop for every 1 % mismatch) Design primem a sond Gibbsova (volná) energie a její změna • Sekundární struktura DNA • AG závisí na změně vnitřní energie a entropie • Změna volné energie AG° (množství energie uvolněné nebo absorbované během reakce za stejné teploty a tlaku) - spontánní reakce - AG<0 • Znalost termodynamického příspěvku párování bazí, mismatches, volných konců, vlásenkových struktur a smyček - predikce parametrů hybridizace • Predice sekundární struktury - nearest neighbor - helix initiation factor (G C/'AT) - helix propagation energie nutná pro vytvoření následujícího hybridizačního páru - symetrie sekvence (duplexu) - Loop regions - smyčky, vlásenky, výdutě atd. Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu 1. Počet odpovídajících párů bazí - Kombinace vodíkových můstků a hydrofobních interakcí - Pozice a typ neodpovídajícího páru {mismatch) 2. Sekvence - nearest neighbor 3. Sekundární struktura - Charakter cílové sekvence - Kompetice primem nebo sondy s komplementárním řetězcem cílového duplexu 4. Volné konce - Interakcej3i9ž-5^a 3' konci hybridizovaného oligonukleotidu a nejbližší sousedící báze ( j - Příklad:^—^ GTAGACAATCTCCATCTCCTATCCTGATTAGAG ******************** AG° (AT) -0,50 kcal/mol AG° W-C (TA/AT) -0,58ckcal/mol AG° W-C (GC/CG) -2,24 kcal/mol GTTAGAGGTAGAGGATAGGA Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu 5. Iontová síla - Koncentrace iontů, zejména Mgll+ - Kationty kompenzují negativní náboj fosfátových skupin a usnadňují formování duplexu - Stabilita duplexu (Tm) je úměrná koncentraci iontů 6. Teplota - Se stoupající T je udržení duplexu energicky náročnější, po překročení určité T je preferována ssDNA- vyšší entropie celého systému Není tedy nutná shodná Tm, ale shodná účinnost hybridizace obou primem. Primery se stejnou Tm, ale rozdílnou AG°, mohou vykazovat rozdílnou úspěšnost při tvorbě duplexu než primery s odpovídající AG°. Design primem • Optimálně: primery jejichž 5'konce tvoří stabilní duplex, AG° <10 kcal/mol/37°C • Plynulý přechod AG° směrem k 3'konci až k cca -6kcal/mol. • Eliminace misprimingu (vzniklého hybridizací pouze 3'konce) • Vyloučení repetitivních oblastí, které mohou tvořit sekundární struktury • Komplementarita primem - primer dimery • Specifita - hybridizace k jedinečnému místu v genomu (BLASTn) Vliv reakčního prostředí - i ideálně navržené primery mohou měnit své vlastnosti v závislosti na použitém PCR pufru a dalších parametrech PCR -vždy je nutná optimalizace jednotlivých PCR ATCCTATGGTTGTTTGGATGGGTG Design sond • Různý design podle toho, zda je cílem kvantifikace DNA, mRNA nebo provedení alelické diskriminace nebo SNP • Použitá chemie • Detekce DNA, RNA nebo obou zároveň? Rozlišení HIV RNA od DNA začleněné do genomu • Kombinace fluoroforu a zhášeče • Modifikace sondy - LNA, PNA, MGB atd. • Multiplex assay Design hydrolyzačních sond • qPCR TaqMan - dvoukrokový proces - denaturace a annealing/extension • Co nejnižší Ct a nejvyšší AR (ARn) • Umístění 5' konce sondy v rámci stanovované sekvence co nejblíže 3' konci jednoho z primem - účinné štěpení sondy • Optimální délka do 30 nukleotidů, obsah GC do 30% • AT bohaté sekvence - začlenění LNA, PNA nebo MGP • G - účinný quencher • Minimum repeticí, zejména GGGG, začlenění inosinu do repetice řeší tento problém • Tm proby od 10°C vyšší než Tm primem Q Design hybridizačních sond (Lightcycler probes) Sondy by měly být umístěny co nejdál od primeru 5' - odečet fluorescence v annealingové fázi GC 50% Každá sonda má délku 23-35bp Sondy o stejné Tm - musí se vázat současně ; Tm sond o 5-10°C vyšší než Tm primem 3' konec akceptorové sondy fosforylován Donor FAM, akceptor Cy5 nebo Lightcycler Red 640/705 Vzdálenost mezi sondami 1-5 bazí (zajištění F R ET) Template dna i: i i i: 11 i Excitation tor donor FRET .......^ j 11 IITTTTTTT Emission by acceptor Detection ^7 Temperature Design primem a sond Design molekulárních majáků Vazba majáku ideálně uprostřed amplikonu Tm komplementárních ramen o 7-10°C vyšší než Tm primem Délka do 39 bp - omezení sekundárních struktur Design scorpion primers PCR Product-Specific Nucleotides Fluorescent Reporter Dye x. R Quencher Dye Sonda připojena k 5' konci primeru a je komplementárni k nově syntetizovanému řetězci • vlastní hybridizace sondy je intramolekulární událost • 17-27bp; Tm sondy jľ*iee> i r.-to HJľ win n ?L^v.nK Real Time PCR Primer Sets ťůlldaiťJ Primer í«s /w ťtaaffrírarítv ífŕaí Time PCR Are you normalizing gene expression to just one housekeeping gene? Set c-f 1 f." Validated Housekeeping Gana Primer Sets ■ Only S79.9S Available at www.reaEtrmeprimars.com Vf- ■■A.-t-Hi. ÍIKHu' III ^■■.I.lln.-Jl ]| Hybridit I Jo D Flot*H j I l^iolyT.a. Plot Quantitative PCR Primer Database S3 Search Primer MISHIlifllBf! Design primem a sond Design primerú a sond- web resources Pnmcr3: VAVW pnmer t. Primer 3 http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3 www.cqig Primer Express http://www.appliedbiosvstems.com ootrilllwr fh-kan (.«■ Premier Biosoft International http://www.premierbiosoft.com PREMIER Biosoft International HOME PRODUCTS SERVICES DOWNLOAD ORDERING Software to Accelerate Research in Life Sciences AllelelD® ■ Real Time PGR & Microarravs Array Designer ■ Microarravs Beacon Designer™ ■ Real Time PGR Oliao Design PrimerPlex ■ Qligo Design for xMAPtB Based Multiplex Systems Primer Premier • PGR Primer Design SimGlycan™ ■ MS/MS Data Analysis SimVector ■ Draw Plasrnid Maps & Plan Cloning Experiments THA Foresight ■ Tissue Migrgarray Data Analysis ^) Xpression Primer ■ Tagged Primer Design Design primem a sond Návrh primem a TaqMan sond - Primer Express 1090..>1143 /gene=r'FOS'r /gene_synonyiin="'AP-1" /gene_synonyiin="'C-FOS " /standard_naiiie='rBP250015AirjG9'r /db xreť='rUniSTS:519218r' 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 atgatgttct tccccggccg ggct-cgcctg attcccacgg ctcgtctcct ccctccgctg cagagcattg agaatccgaa ctgactgata accgagattg cgacctgcct cttgatctga ctgcctctcc agcatggagc agtggctctg gcagactggg gagcccctgt ttcgtcttca ggcagcagca tga cgggcttcaa gggatagcct ctgtggcccc gggcttactc gcaggagggg gggaaaggaa cactccaagc gcaagatccc ctgggggcct tgaagaccga agacagcceg agcctctgca gcactccggt cctaccccga cgcagactac ctcttactac ggacttctgc ctcgaccagt atcgcagacc cagggctggc caaggtggaa taagatggct ggagacagac gaaggagaag tgatgacctg gccagaggtt tgagcccaag gccctttgat ctccgtgcca cagtggctcc ggtcacctgt ggctgactcc gaggcgtcat cactcacccg acggacctgg ccggacctgc agagcccctc gttgtgaaga cagttatctc gcagccaaat caactagaag gaaaaactag ggcttcccag gcc: egg ccctcagtgg gacttcctgt gacatggacc ctggggatgg actcccagct tcgctcagct cctcccgctg ccgtctccag agtggctggt accctttcgg ccatgacagg cagaagaaga gccgcaaccg atgagaagtc aagagatgtc agtctgagga aacctgtcaa tcccagcatc tatctgggtc ggcccatggc gcactgctta gtgcagctgc cagcagcgcg gcagcccgcc aggccgagcg agagaaaagg gaggagggag tgctttgcag ggcagctcac tgtggcttcc gageatcage atccaggccc cttctatgca cacagagctg cacgtcttcc ccaccgcaag gctggccctg Disclaimer | Write to the Help Desk NCBI | NLM I NIH Primer Express5 Software for Real-Time PGR Version 3.0 OCwjiijhl 2004. Applied Biosyslems. All rights resewed Help □ aH I & I x 1 © x I íTaqManffiíMGB Quantification # 1 ■ ■ -H-l ORFJ Ô lš/" i& Sequence: Parameters Primers / Probes Order ffl File Name I I Wi 1143 bp. Selection 1144 □ Double Stranded kTGATGTTCT CAGCAGCGCG J CAGACTCCTT IaCGGACCTGG CTC GAC CAGT CTGTGGCCCC CCCTCCGCTG kGGCCGAGCG CAGAAGAAGA GCAGCCAAAT GGAGACAGAC IcCAACCTGCT ^CGACCTGCCT r&TGGCTTCC AGTCTGAGGA CCCTCAGTGG GCCCTTTGAT AGACAGCCCG GCAGACTGGG CGGGCTTCAA TCCCCC-GCCG CTCCAGCATG CCGTCTCCAG CCGGACCTGC ATCGCAGACC GGGCTTACTC CAGAGCATTG AGAGAAAAGG GCCGCAACCG CAACTAGAAG GAAGGAGAAG GCAAGATCCC CTTGATCTGA GGCCTTCACC AACCTGTCAA GACTTCCTGT CTCCGTGCCA AGCCTCTGCA CGCAGACTAC GGGATAGCCT GGCTCGCCTG TGCCAACTTC AGTGGCTGGT AGAGCCCCTC CAGGGCTGGC GCAGGAGGGG AGAATCCGAA GAGGAGGGAG ATGAGAAGTC GAAAAACTAG TGATGAC CTG CTGGGGGCCT CTGCCTCTCC GAGCATCAGC TCCCAGCATC GACATGGACC CAGTGGCTCC GAGGCGTCAT CTCTTACTAC TCAACGCGCA ATTCCCACGG GCAGCCCGCC ACCCTTTCGG GTTGTGAAGA CAAGGTGGAA GGGAAAGGAA CTGACTGATA TGCTTTGCAG AGTTCATCCT GGCTTCCCAG GCCAGAGGTT TCAATGACCC AGCATGGAGC ATCCAGGCCC TATCTGGGTC CTGGGGATGG CCTCCCGCTG CACTCACCCG GGACTTCTGC TCACTGCCAT CTCGTCTCCT AGTCCCCGCC CCATGACAGG CAGTTATCTC TAAGATGGCT CACTCCAAGC ACCGAGATTG GGCAGCTCAC AAGAGATGTC GCCACCCCGG TGAGCCCAAG TGAAGACCGA AGTGGCTCTG CTTCTATGCA GGCCCATGGC □BE 100 ISO 200 250 300 350 400 450 500 SE0 600 650 700 750 800 850 900 950 To find Primers & Probes, click the "Find Primers/Probes" button Design primem a sond TaqManil) MGB Quantification U 1 Sequence]; Parameters i [ Primers / ProbesjOrder | Parameter Value f£] Primer Tm Min Primer Tm 58 Max Primer Tm 60 Max Difference in Tm of Two Primers 2 [=] Primer GC Content Min Primer %GC Content 30 Max Primer %GC Content 80 Max Primer 3' GC's 2 Primer 3' End Length 5 Primer 3' GC Clamp Residues 0 □ Primer Length Min Primer Length 9 Max Primer Length 40 Optimal Primer Length 20 0 Primer Composition Max Primer G Repeats 3 Max NumAmbig Residues in Primer 0 □ Primer Secondary Structure Max Primer Consec Base Pair 4 Max Primer Total Base Pair 8 0 Primer Site Uniqueness Max X Match in Primer 75 May Consec Match in Primer 9 Max 3' Consec Match in Primer 7 □ Probe Tm Min Probe Tm 68 Max Probe Tm 70 0 Probe GC Content Min Probe %GC Content 30 Max Probe %GC Content 80 0 Probe Length Min Probe Length 13 Max Probe Length 25 3 Probe Composition Max Probe G Repeats 3 Max Num Ambig Residues in Probe 0 No G at 5' End in Probe Select Probe with more C's than G's 3 Probe Secondary Structure Max Probe Consec Base Pair 4 Max Probe Total Base Pair 8 3 Amplicon Min Amplified Region Tm 0 Max Amplified Region Tm 85 Min Amplified Region Length 50 Max Amplified Region Length 150 3 General Max Primers / Probes 50 Design primem a sond ĚiTaqMan® WGB Quantification # 1 f Sequence} Parameters] Primers / Probes [ Order| 0 r Candidate Primers & Probes— F1 [Fwd Start I [ Fwd Stop [Fwd Len... [ FwdTm ][Fwd^GC ] [ Fwd Seq [ Rev Start ] [Rev Stop JfRevLen... J [ Rev Trn ][Rev%GC ][ Rev Seq ] [Probe i 162 181 20 58 55 CGTCTCCA... 217 199 19 58 63 GGTCCGGA... 183 A- 2 161 180 20 59 60 CCGTCTCC... 217 199 19 58 63 GGTCCGGA... 182 3 161 180 20 59 60 CCGTCTCC... 217 199 19 58 63 GGTCCGGA... 183 4 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 5 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 G 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 7 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 8 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 9 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 10 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 11 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 12 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 13 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 14 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 15 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 16 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 17 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 18 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 19 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 ■—! 20 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 21 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 22 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 820 23 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 820 24 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 821 25 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 821 2G 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 822 27 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 28 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 29 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 30 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 812 793 20 58 50 TCATCAAA... 765 31 1745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 812 793 20 58 50 TCATCAAA... 765 V < mi > 0 Click to show Locations 0Click to show Secondary Structures Design primem a sond Name Value F£] Forward Primers Total primers tested: 35792 GC test passed: 35149 Ambiguity test passed: 963 Clamp test passed: 963 Tm test passed: 963 Avoid Excluded regions test passed: 963 Repeat test passed: 900 Self compare test passed: 741 Limit GC test passed: 214 Sequence compare passed: 84 Reverse sequence compare passed: 83 F£] Reverse Primers Total primers tested: 35296 GC test passed: 34657 Ambiguity test passed: 946 Clamp test passed: 946 Tm test passed: 946 Avoid Excluded regions test passed: 946 Repeat test passed: 861 Self compare test passed: 703 Limit GC test passed: 205 Sequence compare passed: 95 Reverse sequence compare passed: 95 F£] Primer Pairs Total pairs tested: 7885 Amplicon Length test passed: 691 Avoid Excluded regions test passed: 691 Tm Difference test passed: 691 Amplicon Tm test passed: 630 —.....pn - -.......■ ■ ■ p ■ ■ - Q TaqMan Probes Total probes tested: 14450 GC test passed: 14128 Ambiguity test passed: 1178 Tm test passed: 1178 Avoid Excluded regions test passed: 1178 Repeat test passed: 1126 Self compare test passed: 1076 Sequence compare passed: 475 Reverse sequence compare passed: 458 Probe start test passed: 351 Design primem a sond A| B I C D 1 E 1 F a Hl J K L M N O P 1 Q 1 R S 1 T 1 U 1 V 1 W 1 X 1 Y 1 2 3 4 5 6 4 1 Fwd Sta rt 162 Fwd Stop 131 Fw-d Length 20 Fw-d Tm 58 Fwd%GC 55 FwdSeq Rev Start OG TCTCCAG TG CCAACTTCA 217 Rev Stop 199 Rev Length 19 58 Rev%GC 63 RevSeq GGTCCGGACTGGTCGAGAT Probe Start 133 Probe Stop 137 Frcbe Lerž:lh 15 PrsbeTm 69 Probe %GC 67 ProbeSeq TCCCACG G TCACTG C AmpTm 84 Amp%GC 61 Am p Ta 62 Amp Len 56 Penalty 31 2 3 161 íei ISO is-: 20 20 59 59 6C 60 L-L-lj 1 LI LUfllj 1 u L-LAhL- 1 It ■COG TCTCCAG TG CCAACTTC d i. 217 199 199 19 19 58 58 63 63 ígt;;;;-.;t;;tcgagat ggtccggactggtcgagat 132 133 137 137 16 15 69 69 63 67 TTCCCACG G TCACTG C TCCCACG G TCACTG C 85 85 61 61 62 62 57 57 36 36 1 5 745 762 IS SB ei CCCAAGCCCTCAG TGG AA 809 790 20 59 55 TCAAAG G GCTCG GTCTTCAG 765 73C 16 68 50 TGTCAAGAGCATCAGC 83 57 61 65 77 745 762 13 58 61 CCCAASCCCľCAG TGG AA 809 790 2G 59 55 TCAAAG G GCTCG GTCTT CAG 765 731 17 69 47 TG TCAAG AG CATCAG CA 83 57 61 65 77 7 e 745 762 13 58 si CCCAAGCCCTCAG TGG AA 809 790 20 59 55 TCAAAG G GCTCG GTCTT CAG 765 782 18 69 50 TG TCAAG AG CATCAG CAG 83 57 61 65 77 3 7 800 822 23 60 48 AG CCCTITGATGACTTCCTGTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 327 344 18 70 61 CATCATCCAG G CCCAG TG S4 60 62 65 80 9 10 3 soo 322 23 60 48 AG C CCTTT G AT G A CTTCCTG TTC 564 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 345 18 70 61 ATCATCCAG G CCCAG TG G 34 60 62 65 so 3 soo 745 P.?? 762 23 IS so 53 4S 61 í n rri-rn-nůTn ů rTTrrT^TTr CCCAAGCCCTCAG TGG AA rm 810 _BAL. 731 _La. 2G _sa 58 -£7 GGAG CG G G CTGTCTCAGfl 50 ATCAAAG G GCTCG G TCTTCA _323. 765 _aas. 780 _IX 16 68 ^ 50 TrůTrrůnnrcrAGTGG 34 TG TCAAG AG CATCAG C s3 60 56 62 60 65 66 80 32 12 13 11 12 745 745 762 762 IS 13 SB 58 61 61 cccAAlIcccIcAlíIlíiJAA cccaagccctcag tgg aa s1u 810 -79T 731 -2tr 20 -58-58 -SO ATCAAAG 5 GCTCG 5 TCTTCA- 50 ATCAAAG G GCTCG G TCTTCA -765" 765 -7BT 7S2 -rr 18 ty 69 4f 50 TGTCAAG AG CATCAG CA 83_56 60 TG TCAAG AG CATCAG CAG "1 izl Šil 60 ee 66 82 82 14 13 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAG TGG AA 810 790 21 59 5-2 ATCAAAG G GCTCG G TCTTCAG 765 780 16 63 50 TGTCAAGAGCATCAGC ~| 83] ŠěJ 60 66 83 15 14 745 762 IS SB 61 CCCAAGCCCTCAG TG-G AA 530 790 2L 59 52 ATCAAAG G GCTCG G TCTTCAG 765 731 17 69 47 TG TCAAG AG CATCAG CA 83,1 56 60 66 83 16 15 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAG TGG AA 810 790 21 59 52 ATCAAAG G GCTCG G TCTTCAG 765 782 18 69 50 TG TCAAG AG CATCAG CAG 1 Í3I 56 60 66 83 17 16 799 321 23 60 48 GAGCCCTTTGATGACTTCCTGTT 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 327 344 18 70 61 CATCATCCAG G CCCAG TG 1 84 61 62 ee 85 18 19 20 21 17 799 321 23 60 48 GAGCCCTTTGATGACTTCCTGTT 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 328 345 18 70 61 ATCATCCAG G CCCAG TG G s4 61 62 ee 85 13 13 20 799 321 23 60 48 GAGCCCTTTGATGACTTCCTGTT 564 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 329 345 17 69 65 TCATCCAG G CCCAG TGG 84 61 62 66 85 745 762 IS SB 61 CCCAAGCCCTCAG TGG AA 811 792 20 58 55 CATCAAAG G G CTCG GTCTTC 765 780 16 63 50 TGTCAAGAGCATCAGC 83 57 61 67 87 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAG TGG AA 311 792 2G 58 55 CATCAAAGGGCTCG□TCTTC 765 731 17 69 47 TG TCAAG AG CATCAG CA 83 57 61 67 87 22 21 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAG TGG AA 311 792 20 58 55 CATCAAAG G G CTCG GTCTTC 765 782 18 69 50 TG TCAAG AG CATCAG CAG 83 57 61 67 87 23 24 22 793 313 21 59 52 CG AGCCCTTTG ATG ACTTOCT 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 320 335 16 69 50 TTCCCAG CATCATCCA 85 61 62 67 88 23 798 313 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 3E- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 320 336 17 69 53 TTCGCAG CATCATCCAG 35 61 62 67 sb 25 24 733 813 21 59 52 cc aeccctttí: atgacttcct e í - 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 321 335 15 69 53 TCCCAG CATCATCCA 85 61 62 67 88 26 25 793 313 21 59 52 CG AGCCCTTTG ATG ACTTOCT 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 321 336 16 69 56 TCCCAG CATCATCCAG 85 61 62 67 88 27 26 793 313 21 59 52 CG AGCCCTTTG ATG ACTTOCT 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 322 334 13 69 62 CCCAG CATCATCC 85 61 62 67 88 23 29 30 2? 23 793 313 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 327 344 18 70 61 CATCATCCAG G CCCAG TG 85 61 62 67 88 798 313 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 564 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 325 345 13 70 61 ATCATCCAG G CCCAG TG G 35 61 62 67 sb 23 733 813 21 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 864 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 329 345 17 69 65 TCATCCAG G CCCAG TG G 85 61 62 67 88 31 3-: 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAG TGG AA 312 793 20 58 50 TCATCAAAG G G CTCG GTCTT 765 780 16 68 50 TGTCAAGAGCATCAGC 82 56 60 63 92 32 31 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAG TGG AA 312 793 20 58 so TCATCAAAG G G CTCG GTCTT 765 731 17 69 47 TGTCAAG AG CATCAG CA 82 56 60 63 92 33 34 35 32 33 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAG TGG AA 312 793 20 58 so TCATCAAAG G G CTCG GTCTT 765 782 18 69 50 TG TCAAG AG CATCAG CAG 82 56 60 63 92 797 31E 20 5E 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 320 335 16 69 50 TTCCCAG CATCATCCA 85 62 62 63 92 34 797 316 20 58 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 320 336 17 69 53 TTCCCAG CATCATCCAG 85 62 62 63 92 36 35 797 316 20 58 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 321 335 15 69 53 TCCCAG CATCATCCA 85 62 62 63 92 37 36 797 316 20 58 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 321 336 16 69 56 TCCCAG CATCATCCAG 85 62 62 63 92 33 39 37 797 316 20 58 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 564 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 322 334 13 69 62 CCCAG CATCATCC 85 62 62 63 92 33 797 31E 20 58 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA Z22 336 15 68 60 CCCAG CATCATCCAG 85 62 62 63 92 40 33 797 816 20 58 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 323 337 15 68 60 CCAG CATCATCCAG G 85 62 62 63 92 41 42 LZ 41 797 816 20 58 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 327 340 14 68 64 CATCATCCAGGCCC 85 62 62 63 92 797 316 20 58 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 327 3-2 16 68 63 CATCATCCAG G CCCAG 85 62 62 63 92 43 44 45 -2 -3 44 797 316 20 58 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 564 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 327 344 18 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 35 62 62 63 92 797 31E 20 58 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 323 345 18 70 61 ATCATCCAG G CCCAG TG G 35 62 62 63 92 797 816 20 58 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 329 345 17 69 65 TCATCCAG G CCCAG TG G s5 62 62 63 92 46 45 797 816 20 58 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 330 345 16 68 69 CATCCAG G CCCAG TG G 35 62 62 63 92 47 43 451 800 822 23 60 48 AG C CCTTT GAT G A CTTCCTG TTC 867 351 17 59 71 CAOG G AGCG G GCTG TCT 327 344 18 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG s4 60 62 63 96 471 boo 322 23 60 48 AG C CCTTT G AT G A CTTCCTG TTC 3Ě7 35-1 17 59 71 CACGGAGCGGGCTGTCT 323 345 18 70 61 ATCATCCAG g CCCAG TG G 34 60 62 63 96 49 50 43 43 soo 822 23 60 48 AG C CCTTT GAT G A CTTCCTG TTC 867 351 17 59 71 CACGGAGCGGGCTGTCT 329 345 17 69 65 TCATCCAG g CCCAG TGG 84 60 62 63 96 796 816 21 59 52 ACCG AG CCCTTTG ATG ACTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 320 335 16 69 50 TTCCCAG CATCATCCA 85 61 62 69 98 51 SÔ] 796 816 21 59 52 ACCG AG CCCTTTG ATG ACTTC 36- 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 320 336 17 69 53 TTCCCAG CATCATCCAG 85 61 62 69 98 =o 1 1 Design primem a sond Applications & Technologies Log In or Register to see your product prices & to place orders. Learning S Events [?~| Store help I Enter search term 11 All CategolT Products > Real-Time PCR > Gene Expression Assays, Plates B. Arrays > Assays > TaqMan® Gene Expression Assays TaqMan® Gene Expression Assays Click a tab below to learn more about TaqMan Gene Expression Assays. To Find and order assays, click the Search tab. Ordering Information Product Description Litera tu re/Support Assay Search To begin, select a search method below - Keyword: Search by gene symbol, gene namer public accession number biological process or "nolecular Function, - Batch ID: Search by uploading a file containing multiple assay IDs, RefSeq accession numbers, GenBank GI £s, LocusLink IDs, gene symbols, IMAGE Clone IDs, or species. Keyword Search | Batch ID Search Search For Q [P] Disable viildcard search + Advanced Keyword Search Choose Species © www.appliedbiosystems.com Filter by Amplicon Lengths □ H. sapiens g A. thaliana [P Amplic on length less than 70 □ R norvsgitus Q □ . melanogaster [T Amplic an length between 71 and B5 □ M musculo H C. elegans Amplic on length beh-jeen SS and LOO □ M mulatta (Rhesus] C. famrlraris (Canine) |T Amplic on length greater than or equal to 101 □ C rent. (Zebrafish] □ E taurus [Cow) □ G. gallus [Chicken] @ C. cuniculus (Rabbit) □ S scroFa (Pig) Choose Set Membership © u ;e: = ^T -II ex :li-des Gene Copy Number Assays) © Search Gene Copy Number Assays © Limit Assay Sets to: TARGET CLASS ASSAY ATTRIBUTE □ Apoptosis |T] AmbionsiRNA □ Fusion 0 Endogenous Transcripts Controls □ 3' Mc = l COLLABORATOR SET5 □ Immune Tolers Netviork Order.q Information Your search fcmLc-Fos in you viish to refii^^your s results by other criteria. Product Description Specifications Literature/Support I Related Products All Teit 1 returned 2.7 results. ( Species: Homo sapiens Amplicon Length: ALL Set Membership: ALL ) earth results by product availability, click a radio button below, and then click Filter Results. To filter y select from the categories: list to the left of your results, Previous | 1 | 1 | Next Filter Results by aa ability 0 Inventoried Assays Made to order Assays ° Inventoried and Made to order Assays Flter Resufts Please Log In to add products to your Shopping Basket/Favor it esr configure a product, or to view products available fo Panther Classification: pur-chase in your country. I 25 items/page | -w \ b " * Assay ID ® Availability ►Gene ► G> ® Symbol N; Alignment Map osteosarcoma viral oncogene ► GenBank ► Species ► Amplico m RNA Length nk Homo nk Homo 77 sapiens Assay ID 1. -=■£=■■ ID Details: Hs00170S30_ml Alignment Map siRNAs EV Related Products Availability ® Inventoried ► Gene Symbol FOS ► Gene Name v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog Alias ► RefSeq ► GenBank m RNA ► Species ► Amplicon Leng AP-L NM_005252.2 5 GenBank Homo C-F03 mRNAs sapiens 77 Design primerů a sond Roche Applied Science Czech Republic Login Quick Order Shopping Cart Help Ccmtacl Us Home Products Special Interest Sites Support S Resources News Genomic Systems --- Real-Time PCR Systems =■ Universal ProbeLibrary System Universal ProbeLibrary Real-Time PCR Systems ► LightCycler* Carousel-Based System ► LightCycler* 4S0 System ^ Universal ProbeLibrary System ► System Description ► Technology ► Assay Design Center ► User Statements and Application ► Assay List ► Performance ► Product List ► Support ► Literature and References ► Multimedia Presentations ► Product Information and Pack Inserts www.universalprobelibrary.com Gene Expression Quantification with Real-Time PCR - Simple and Fast ♦ Design real-time qPCR assays online in seconds. * Rely on just 165 prevalidated probes for over five million qPCR assays for a large variety of organisms. + Reduce the cost of gene expression analysis by performing multiple)! qPCR assays with Universal ProbeLibrary Reference Gene Assays. Universal ProbeLibrary for Human Specify your target(s): -By sequence ID, gene name or keyword — e.g. ENST00000331789, NM_001101 orX0u351 or fceta-actin Roche Applied Science Advanced primer3 settings -By sequence- e.g. >paĽt cf X0Ü351 thiinan liRNA fcĽ beta-actin CiCaMTCGTCiCCMCIGOGfiCGACATGGAGfiiAAICTGGCACCACfiCCIICIfiCAAI GftGClGCGIGTGGCICCCGftGGAGCftCCCCGIGCIGClGACCGaGGCCCCCCIGMCCCC MGGCCMCCGCGAGMGfiIGACCC6GiTC6IGIITGAGACClTC6AC!iCCCCAGCCATG lACGIIGClAICCAGGClGIGClMCCClGIACGCClClGGCCGIACCJlClGGCAICGIG AIGGACTCCGGIGACGGGGICACCCACACIGIGCCCMCTACGAGGGGIATGCCC1CCCC EH Automatically select an intron spanning assay. D Design multiples PCRwith reference gene Design primem a sond Real-Time PCR Systems ► LightCycler* Carousel-Based System ► LightCycler* 4S0 System Universal ProbeLibrary System ► System Description ► Technology T Assay Design Center ► Pack Inserts ► Assay Design Guide ► Quick Reference ► Probe No. Conversion ► Need Help? ► User Statements and Applicatio-n ► Assay List ► Performance ► Product List ► Support ► Literature and References ► Multimedia Presentations ► Product Information and Pack Inserts Please choose the sequence^] you would like to continue with. You can select up to 10 sequences. Name Length Description □ ENST00000400991.1 2569 □ ENST00000303562.2 2103 □ ENST00000297904.2 2110 B NM_003367.2 1732 B NM_207291.1 1531 B NM 003131.2 4-343 B NM 004469.2 2128 B AB022275.1 300 □ AB022276.1 700 AL139130.28-201 Clone_based_ensemblJranscri Transcriptional activator of the c-fos promoter GR0G4(CROC-4). [So urce: U ni p rcfSPTRE M B L;.Acc:Q8 N 964] FOS-201 HC Proto-oncog tos>[G0/G1 [Source:Uni B AB209128.1 5672 □ AF126533.1 238 Homo sapie FIGF-001 H< endothelial [c-fos-induc [Source:Uni Homo sapie c-fos interac Homo sapie c-fos interac Homo sapie response el tSRF), mRN Homo sapie (vascular en mRNA Homo sapie partial cds Homo sapie partial cds Homo sapie [c-fos serun transcription ProbeFinder has designed the optimal real-time PGR assay for: NM 003367.2 Homo sapiens upstream transcription factor 2, c-fos interacting (LSF2J, transcript variant 1, mRNA. Assay details: Use Universal ProbeLibrary probe: #26, cat.no. 04687574001 Primer Length Position Tm %GC Sequence Left Primer 1Ě 449 - 466 60 67 gt g a c c c aggt gggt gt g Right Primer 21 540 - 560 59 43 tgaagggattttggatcacag Amplicon (112 nt) gtgacccaggtgggtgtggacggggcagcccagcgcccgggccccgccgctgcctctgtg cccccaggtcctgcagcgcccttcccgctggctgtgatccaaaatcccttca | Download pack insert | | PDF report | | Text report | | Order probes or set~| Transcript overview: 26 TTT—l HU A 1732 439 Design primem a sond Universal ProbeLibrary Po dnešní přednášce: - Rozumíte vlastnostem primem i základních typů sond a znáte faktory, které ovlivňují jejich hybridizaci a účinnost - Umíte navrhnout optimální sekvenci primem i hydrolyzační sondy pomocí dostupných programů a rozumíte parametrům designu