EVROPSKÁ UNIE MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ. OPVzdělávání MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkureneesclwpiiwt INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky UVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR VI. Aplikace qRT-PCR Aplikace 1. Detekce DNA Diagnóza infekčních onemocnění (přítomnost patogenů v krvi, séru, plazmě ...) - Sledování minimální reziduálni nemoci - Detekce patogenů v potravinách a v životním prostředí - Detekce GMO - Autenticita potravin 2. Detekce RNA - Minimální reziduálni onemocnění (Her2 - karcinom prsu, Bcr-Abl - CML, ELAVL-4 - neuroblastom) - Detekce RNA virů - Diagnóza nádorových onemocnění (PSA - karcinom prostaty) - Validace microarray experimentů 3. Detekce SNP a alelická diskriminace 4. High Resolution Melting Analysis 5. Kvantifikace množství (konkrétních) proteinů Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Diagnóza - rychlá, citlivá a přesná determinace patogenů Klasické kultivační metody - časově náročné (24-48hod), nízká citlivost, omezené spektrum druhů qRT-PCR - např. geny kódující 23S rRNA nebo 16S rRNA Rutinní diagnostika - Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumonieae Monitoring zneužitelných druhů - biodefense Yersinia pestis, Bacillus anthracis Výzkum - testování antibiotik - multidrug resistant strains (analýza bodových mutací v genech zodpovědných za metablismus ATB) - Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus Houbová a parazitární onemocnění - Aspergillus fumigatus, Candida sp. - Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Příklad protokolu: Detekce Prevotella intermedia Stěr z úst Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, cfg. 20min/15 OOOg Izolovat bakteriální DNA ze supernatantu Návrh primem (Primer Express) - oblast 16S rDNA Např.: Forward: 5'-AATACCCGATGTTGTCCACA-3' Reverse: 5'-TTAGCCGGTCCTTATTCGAA-3' Reakční směs PCR 2x SYBR green Master Mix (Applied Biosystems) 26,0|liI 95°C 1min Forward primer (10|uM) 2,0|liI Reverse primer (10|uM) 2,0|liI 95 <€ 15s PCR grade H20 15,0|liI 60 <€ 1min Vzorek DNA nebo standard 5,0jllI Aplikace Aplikace v klinické virológii Typizace virů (např. chřipka) nepřítomnost signálu - variabilita v sekvencích/falešně negativní výsledky Hydrolyzační (TaqMan) i hybridizační sondy Kvantifikace - virový titr např. hepatitída B/C, HIV, EB, cytomegalovirus atd. Transplantace Detekční limity - genomové ekvivalenty (ge) End-point analýza - detekční limit 5x101 ge; dynamický rozsah 101-104 ge Hybridizační analýzy - detekční limit 2x101 ge; dynamický rozsah 101-104 ge Inter- a intra assay variabilita >40% gRT-PCR - detekční limit 1x101 ge; dynamický rozsah 101-108 ge Inter- a intra assay variabilita <5-10% Interní amplifikační kontrola - Paralelní PCR známého standardu - Tzv. „Spiking" vzorků známými sekvencemi - Paralelní analýza příbuzného viru (např. pro lidský HSV - tulení PhHV) Aplikace Aplikace v klinické virologii Příklad protokolu: Detekce viru chřipky (Influenza A) - 5' nukleázová assay Stěr z nosohltanu Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, Izolovat virovou RNA ze supernatantu Návrh primerů a sondy (Primer Express) - oblast M1 (influeznaA matrix gene) Např.: Forward: 5'-CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3' Reverse: 5'-GGTGACAGGATTGGTCTTGTCTTTA-3' Sonda: Fam-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAG-BHQ+ Reakční směs - One Step PCR (Qiagen) PCR Qiagen One Step RT-PCR Enzyme Mix 1 ,0JLXI 50^0 20min (Reverzní transkripce) Qiagen One Step RT-PCR Buffer (5x) 5,0|liI Qiagen One Step RT-PCR dNTP mix (1 OmM) 1 ,0JLXI 95^0 15min (Aktivace polymerázy) Forward primer (10iiM) 2,0|liI 1 "A Reverse primer (1 OiiM) 2,0|liI 95<€15s ľ \ Sonda (20|liM) 0,2|liI 60<€1min V__y PCR grade H20 8,8|liI Vzorek DNA nebo standard 5,0|liI Aplikace http://www.idahotec.com/BioDefense/ Terénní qRT-PCR - Detekce patogenů mimo laboratoř - Komerční specializovaná řešení http://www.rapidcycler.com/GSA/index.html Aplikace Jednonukleotidové polymorfismy SNP DNA sekvence lišící se v jediném nukleotidu Kódující i nekódující oblasti Záměna nukleotidu nemusí nutně vést k záměně AA 1 Variabilita v odpovědi k patogenům, léčivům, atd. Senzitivita k onemocněním http ://www. nebi. n I m. n i h. gov/proj ects/S N Pl % NCBI Single Nucleotide Polymorphism ^^^3^ PubMed Nucleotide 5 Protein Genome Structure PopSet Taxonomy OMIM Books SNP| I Search for SNP on NCBE Reference Assembly || Search Entrez SNP 0 for Go Aplikace SNP genotypizace • TaqMan • Invader assay (Flap endonukleáza) • SNP microarray Invader assay in which probe complements the SNP resulting in fluroescene Invader assay in which probe mismatches at the SNP location preventing cleavage from occuring no FEN cleavage site Reference: Based on Olivier M.2005.The Invader assay for SNP genotyplng. pcr a m pi ifi cation of I ocati o n of nja oh wash a nd attach ment interest wfth blotlnylated primer to streptavidin Hybridization of pcr product with an allele specific probe in the presences of a DNA duplex bfndmg fluorescence molecule The temperature at which the DMA hybrid denatures and fluorescence is lost is recorded and compared between assays with different probes Aplikace SNP genotypizace APEX (Arrayed primer extension) - 2D matice, oligonukleotidy imobilizované 5'koncem - PCR produkt je hybridiziován a prodloužen DNA polymerázou - Fluorescenčně značené terminátorové nukleotidy Tetra-primer based PCR pi C allele specific A allele specific P3 A DNA: G allele 9 C P4 P2 PI DNA: A allele i C P4 P2 PCR PCR product Gel electrophoresis PCR product qiq homozygote G/A heterozygote A/A homozygote Not allele specific G allele specific A allele specific Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza Forward Primer J 4 ■■"ííLc 17 ■ 7 5' Revsrse Filme r rtrO'f......^mO. .TtTn Allele Match Mismatch Allele rfrO.-TT Mitch I I ľv J i i i n i i i Mismatch 3p) Legend v Fluoritem Probe Q Reporter ® Fluorescent Probe '.ňcé:; mí nor Groove Binder Quencher TSfl ONA. Polymerase 9 Molecular Probe Target Sequence Emission of Fluorescence x Undetermined * Allele X * Allele Y • Both ■ iMTC __m_ 2. Jsou použity oligonukleotidy hybridizující k nemetylovaným sekvencím a blokující PCR Aplikace ImunoPCR - Vazba specifického oligonukleotidu k monoklonální protilátce - Protein (Antigen) je imobilizován jinou monoklonální protilátkou - Vzniká sendvič (assemblage) - podobně jako ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) -tzv. PCR- ELOSA (Enzyme-Linked Oligonucleotide Sorbent Assay - Množství oligonukleotidu imobilizovaného prostřednictvím mAb je kvantifikováno PCR Aplikace ImunoPCR Fig. 5. Real-time immuno-PCR (assemblage II) (■) and EL1SA (A) readouts of standard samples (logarithmic scale). Aplikace ImunoPCR - stanovení PSA v laser-mikrodisekovaných buňkách Human Pathology (2008) 39, 1474-1482 ELSEVIER Original contribution Human PATHOLOGY www,clscvier.com/locate/hiimpath Prostate-specific antigen mRNA and protein levels in laser microdissected cells of human prostate measured by real-time reverse transcriptase-quantitative polymerase chain reaction and immuno-quantitative polymerase chain reaction Pamela Pinzani PhDa, Kristina Lind PhDbd, Francesca MaLentacchi GabrieLLa Nesi MDC, Francesca SaLvianti PhDa, Donata ViUari MDf, MikaeL Kubista PhDde, Mario PazzagLi PhDa, Claudio Orlando PhDaJ 10 000 two II El BR ŕ; T 0 □ nflHA i. ffil'FdlLI^ I-1-1-1-1-f-1 NI Ni 113 M IIS N6 HT R- 0 5B0: P-J0I01 4> H3W00 30QQW PSA PfíTŕio —i-1-r~ iWKm itram «oom] Ii4le»l) Aplikace Single cell profiling B Total number of *j transcripts - 6 Total number of *j transcripts = 6 Total number of ^ transcripts = 7 Total number of \ transcnpts = 6 Total number of ^ transcripts = 7 Total number of ^ transcripts = 6 Cell collection Cell lysis Reverse transcription Real-time PCR Data analysis glass capillaries flow cytometry laser capture pjriH cation detergents heat osmotic mechanic • reverse transcriptase • priming »temperature profile • pre-ampliflcation mastermix priming temperature profile ■ detection chemistry pre-amp I ifi cation • normalization • quality assessment • statistics Stahlberg A. and Bengtsson M. 2010. Methods 50(4):282-288 Aplikace Circulating tumor cells (CTCs) Alluni-Fabbroni. 2010. Methods 50(4):289-297 Aplikace Amplifikace DNA bez PCR? Helicase-dependent isothermal DNA amplification 1. 2. 3. dsDNAje denaturovaná pomocí helikáz a SSB proteinů Primery hybridizují ke komplemntární sekvenci Polymeráza doplní ssDNA na dsDNA, která slouží jako substrát helikázám 13 Li. LX LL o 3 £ ■ 1 rt \ — 1—1 1—1 1—1 1—1 1—1 1—1 1—1 1—1 1—1 i—i i—i i—i i—i 3 i-■ 1-1 1-1 1-■ 1-1 I-1 i—i ■—\ 10 20 30 40 50 60 70 60 90 100 110 Time (min) HelicaseS unwind DNA duplexes in the presence of SSB and accessory protein 3' V V.. Píirners anneal to SsDNA 5' DNA polymerases extend Ý the primers: one duplex is amplified to two duplexes dsDNA are separated by helicases and this chain reaction repeats itself