Bi9393 Analytická cytometrie
Oddělení cytokinetiky
Biofyzikální ústav AVČR
Královopolská 135
612 65 Brno
e-mail: ksoucek@ibp.cz
tel.: 541 517 166
Karel Souček, Ph.D.
Lukáš Kubala, Ph.D.
Pavla Gajdušková, Ph.D.
Eva Bártová, Ph.D.
Eva Slabáková, Ph.D.
Alena Vaculová, Ph.D.
Struktura kurzu
 Přednášky
- 8 lekcí o průtokové cytometrii a aplikacích
- 1 lekce o mikroskopii
- 3 lekce zaměřené na „microarrays“
 Cvičení
Součástí kurzu je praktické cvičení. Přesto bude jedna přednáška věnována praktické
demonstraci. Vybraná zařízení budou demonstrována přímo v laboratořích BFÚ
 Test
Kurz bude zakončen zkouškou ve formě testu shrnujícího látku za celý semestr. Výsledek testu
bude tvořit 75% celkového hodnocení.
 Seminář
Každý student bude prezentovat krátký seminář jehož téma bude konzultováno s přednášejícím
a bude se týkat zaměření kurzu. Téma semináře bude shrnuto v krátkém textu ve stylu
hesla pro CZ Wikipedii. Na základě této prezentace a odevzdaného textu bude udělen
zápočet a hodnocení vlastního semináře se bude také z 25-ti % odrážet v celkové známce.
Seminář studentů
 Téma semináře musí vycházet z probírané
technologie a musí být schváleno
přednášejícím.
 Cílem je demonstrovat pochopení principů ze
kterých vychází a jejich uplatnění v biologii.
 Prezentace musí být připravena např. v
PowerPoint(u). Prezentaci je nutné předložit v
předstihu přednášejícímu ke konzultaci a
posouzení.
 Maximální délka prezentace je 15 minut a
nesmí být kratší 10-ti minut.
 Obsah prezentace shrnout v krátkém „Wiki“
textu.
Seminář studentů – příklady témat
 Základní principy průtokové cytometrie
 Analýza dat z průtokového cytomeru
 Základní principy separace pomocí průtokové cytometrie
 Principy fluorescence a fluorescenční značky
 Základy detekce fluorescence a zpracování signálu.
 Aplikace průtokové cytometrie
– Imunofenotypová analýza krevních destiček.
– Využití průtokové cytometrie v diagnostice alergických onemocnění.
– Analýza DNA pomocí průtokové cytometrie.
– Aplikace průtokové cytometrie při studiu imunologie bezobratlých.
– Chromozómová analýza pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie.
– Extracelulární detekce cytokinů.
– Monoklonální protilátky v průtokové cytometrii.
– Imunofenotypová analýza periferních lymfocytů.
– Využití průtokové cytometrie v cytogenetice.
– Stanovení buněčné viability.
– Metody detekce apoptózy.
– Měření enzymatických aktivit pomocí průtokové cytometrie.
– Zdroje excitace a optické systémy v průtokové cytometrii.
– Detekce CD4+ T buněk u HIV pozitivních pacientů.
– Aplikace FRET a FRAP.
– Víceparametrové analýzy v průtokové cytometrii.
– Průtoková cytometrie v diagnostice nádorových onemocnění.
– Intracelulární detekce cytokinů.
– Imunofenotypová analýza krevních destiček.
– Využití průtokové cytometrie v diagnostice alergických onemocnění.
Informační zdroje – průtoková
cytometrie
 Practical Flow Cytometry, Howard M. Shapiro, Wiley-Liss; 4th edition
 Cytometry: New Developments, Volume 75, Fourth Edition (Methods in
Cell Biology), Zbigniew Darzynkiewicz, Academic Press; 4th edition
 Průtoková cytometrie v klinické praxi, T. Eckschlager a kol., Grada 1999
 Flow Cytometry with Plant Cells: Analysis of Genes, Chromosomes and
Genomes; Jaroslav Dolezel (Editor), Johann Greilhuber (Editor), Jan Suda
(Editor), February 2007
Více informací o knihách o průtokové cytometrii najdete na:
http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/books/bookindx.htm
Tyto knihy je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ.
Informační zdroje – průtoková
cytometrie (metody a protokoly)
 The Handbook of Flow Cytometry Methods
 Current Protocols in Cytometry
Tyto knihy je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ.
www.cyto.purdue.edu/.../slide0046_image018.jpg
Více informací o knihách o průtokové cytometrii najdete na:
http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/books/bookindx.htm
Informační zdroje – cytometrie
(časopisy)
 Cytometry Part A
http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/33945
 Cytometry Part B: Clinical Cytometry
http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/102019902
Jednotlivá čísla Cytometry Part A (od roku je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ.
Informační zdroje – cytometrie
(CD-ROM)
Je možné zapůjčit po domluvě.
Informační zdroje – (Internet)
 Purdue University, Cytometry Labs
http://www.cyto.purdue.edu/
 International Society for Analytical
Cytology
http://www.isac-net.org/
 Molecular Probes (Invitrogen)
http://probes.invitrogen.com/handbook/
Informační zdroje - mikroskopie
 Taatjes D. J. Cell Imaging Techniques, Methods and Protocols,
Humana Press, Totowa, New Jersey, 2005
 Stephens D. Cell Imaging, Scion Publishing Ltd., 2006.
 Pawley, J. (Ed.), Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed.,
2006
Tyto knihy je možné zapůjčit ke studiu do knihovny BFÚ.
Informační zdroje - microarrays
 Microarray Analysis, Mark Schena, Wiley-Liss 2003
 Guide to Analysis of DNA Microarray Data, Second Edition, Steen
Knudsen, Wiley-Liss 2004
 DNA microarrays: a molecular clonning manual. Bowtell D, Sambrook
J., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2003.
Tyto knihy je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ.
Obecný úvod do průtokové
cytometrie
 Základní principy, možnosti průtokové
cytometrie a její aplikace
 Historie
Tyto částice mají něco společného …
Algae
ChromosomesBlood cells
Protozoa
… určité parametry těchto částic mohou být měřeny
pomocí průtokové cytometrie.
Komerční zařízení
Co můžeme analyzovat pomocí
průtokové cytometrie?
 Počítat částice v suspenzi
 Oddělit živé částice od neživých
 Hodnotit 10*5 až 10*6 částic za méně
než 1 minutu
 Kvantifikovat rozptyl světla, ale i
intenzitu fluorescence
 Fyzicky separovat jednotlivé částice
(populace) pro další analýzu
Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Jaké jsou principy?
 Rozptyl světla (Light scatter) pomocí laseru
nebo UV lampy
 Detekce specifické flurescence
 Hydrodynamicky zaostřený proud částic
 Elektrostatická separace částic
 Možnost multivariační analýzy dat
Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Definice
 Průtoková cytometrie (flow
cytometry)
– Meření vlastností proudících částic (buněk)
 Průtokový sorting (flow sorting)
– Separace částic (buněk) na základě
parametrů měřených průtokovou cytometrií
– také známo jako Fluorescence-Activated
Cell Sorting (FACS)
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Technické součásti
Zdroje světla
Detekční systémy
Fluidní systém
Separace
Sběr dat
Analýza dat
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Technické součásti
Detekční systémy
Fotonásobiče (Photomultiplier Tubes (PMTs))
dříve 1-2
nyní 3-6
Diody
detekce rozptylu světla (light scatters)
Zdroje světla
Lasery (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm)
Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag
UV (Arc) Lampy
Mercury, Mercury-Xenon
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Cytometry Publications/Year
Data taken from
Years
197619771978197919801981198219831984198519861987198819891990199119921993199419951996199719981999200020012002200320042005200620072008200920102011
Papers
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
200000
400000
600000
800000
1000000
flow cytometry
confocal microscopy
all
Historie barvení biologických materiálů
Až do poloviny 19. století – byly používány pouze přírodní barviva
A.van Leeuwenhoek použil v roce 1719 šafrán na obarvení
svalových buněk
www.euronet.nl/users/warnar/leeuwenhoek.html
Historie barvení biologických materiálů
Paul Ehrlich - 1879 použil kyselá a zásaditá barviva pro
odlišení acidofilních,eosinofilních a neutrofilních
leukocytů
Clin Lab Med. 1993 Dec;13(4):759-71.
The Ehrlich-Chenzinsky-Plehn-
Malachowski-Romanowsky-Nocht-
Jenner-May-Grunwald-Leishman-
Reuter-Wright-Giemsa-Lillie-Roe-Wilcox
stain. The mystery unfolds.
Woronzoff-Dashkoff KP.
Princip fluorescenčního Mikroskopu - August Köhler - 1904
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/anatomy.html
Historie barvení biologických materiálů
Andrew Moldavan
Není jasné zda
Moldavan vůbec svůj
„počítač buněk“ sestrojil.
Ve svém, článku popisuje
mnoho problémů, ale
žádné výsledky.
Photo-Electric Technique for the Counting of Microscopical Cells
Andrew Moldavan
Montreal, Canada
Science 80:188-189, 1934
Photo-Electric Technique for the Counting of Microscopical Cells
Andrew Moldavan
Montreal, Canada
Science 80:188-189, 1934
“The purpose of the experiment
is to have each microscopical
cell passing through the
capillary tube, register itself
automatically on the
photoelectric apparatus, thus
creating a micro-current which
can be amplified and recorded.”
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Coons et al 1941 – vyvinuli techniku
fluorescenčního značení protilátek - označili
anti-pneumokokové protilátky pomocí
antracénu. To jim umožnilo detekovat
protilátky i patogeny v tkáni pomocí UV
fluorescence.
Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group
Albert H. Coons, Hugh J. Creech and R. Norman Jones
Department of Bacteriology and Immunology, Harvard Medical School, and the Chemical Laboratory, Harvard University
Proc. Soc. Exp.Biol.Med. 47:200-202, 1941
Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group
Albert H. Coons, Hugh J. Creech and R. Norman Jones
Department of Bacteriology and Immunology, Harvard Medical School, and the Chemical Laboratory, Harvard University
Proc. Soc. Exp.Biol.Med. 47:200-202, 1941
“Moreover, when Type II and III
organisms were dried on different parts of
the same slide, exposed to the conjugate
for 30 minutes, washed in saline and
distilled water, and mounted in glycerol,
individual Type III organisms could be
seen with the fluorescence
microscope……”
Coons a Kaplan (1950) - konjugovali fluorescein s isokyanátem
(FITC) – získali lepší signál – dále od autofluorescence.
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Friedman
Friedman (1950) – kombinoval kyselý
fuchsin, akridinovou žlut´a berberin pro
detekci buněk nádorů dělohy pomocí
fluorescenčního microskopu
Acid Fuchsin
Acid magenta
Acid rubin
Acid roseine
Absorption Max 540-545
von Bertalanffy & Bickis
Ludwig von Bertalanffy (1901-1972)
von Bertalanffy & Bickis (1956)
- metachromatická fluorescence Akridinové oranže byla použita pro detekci RNA v
tkáni
- použili ji také pro rozlišení normálních a nádorových buněk
Absorption Max 467 nm
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Gucker - 1947
 Vyvinul průtokový cytometr pro detekci baktérií v
aerosolu.
 Utajená práce vynikala během Druhé světové války
a byla publikována v roce 1947.
 Cílem byla rychlá detekce vzdušných spór a baktérii
během válečného konfliktu.
 Instrument: Proudí vzduch procházel skrz
osvětlenou komůrku. Jako zdroj světla sloužila
lampa ze světlometu a pro detekci byl použit
fotonásobič.
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
P.J. Crossland-Taylor
„Sheath Flow“ princip
“Provided there is no turbulence,
the wide column of particles will
then be accelerated to form a
narrow column surrounded by
fluid of the same refractive index
which in turn is enclosed in a
tube which will not interfere with
observation of its axial content.”
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Wallace Coulter
 Wallace Coulter Coulter
orifice - 1956 
(patent 1953) – měření
změny vodivosti během
průchodu buněk v
suspenzi malým otvorem
Originální
patentová
aplikace
W.Coultera 1953
Photo by J.Paul Robinson
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Jak počítat buňky?
 Hemocytometer (Bürkerova komůrka) byla
standardem pro počítání buněk do ~ 1950
 Rozměry jsou 3x3x0.1 mm. Obvykle jsou červené
krvinky (1 x 106/mm3 )počítány po naředění 1:200
 Leukocyty (5x103/mm3) jsou ředěny 1:10 v roztoku
lyzujícím červené krvinky
 Statistická chyba:
– koeficient variance (CV) je při 500 spočítaných buňkách
4.4%
– chyba pipetování a ředění je ~ 10%
Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Roche Innovatis
Cedex
Coulter Counter
První komerční verze CC
Coulter Counter
© CC
Beckman Coulter
 Multisizer™ 3&4 COULTER COUNTER®
Roche Innovatis
CASY TT
Cytograph. Stolní přístroj schopný měřit rozptyl světla He-Ne laseru (1970).
Mack Fulwyler- sorter
Mack Fulwyler - sorter 1965 - Los Alamos National Labs – jeho sorter separoval částice
na základě elektronicky měřeného objemu (stejný princip jako Coulter counter) a
separoval pomocí elektrostatického vychýlení.
Cílem bylo sortrovat červené krvinky,protože u nich byla naměřena bimodální distribuce
buněčného objemu. Princip separace byl založen na principu inkoustové tiskárny
Richarda Sweeta ze Stanfordu (1965)
Po té co bylo objasněno, že bimodalita červených krvinek je artefakt byla tato skupina schopna separovat neutrofily a lymfocyty z krve.
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Richard Sweet
Richard Sweet vyvinul elektrostatickou
inkoustovou tiskárnu jejíž princip využil
Mack Fulwyler pro svůj buněčný sorter.
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Mack Fulwyler- sorter
Mack Fulwyler- sorter
K. Souček
Leonard Arthur "Len" Herzenberg
Klíčové „cytometrické“ publikace
 1934: Moldovan – Fotoelektrické meření buněk v kapiláře
 1947: Gucker – fotoelektrické počítání buněk
 1949: Coultrův počítač částic
 1961: Rotman poprvé používá fluorescenci pro kvantifikaci enzymatické reakce
 1964: Sweet – elektrostatická inkoustová tiskárna
 1965: Fulwyler – květen 1965 - patent elektrostatického sorteru
 1965: Kanetsky – spektrofotometrické měření buněk
 1965: Fulwyler – listopad 1965 – publikace o buněčné separaci v časopise Science
 1968: Gohde – první článek o fluorescenční průtokové cytometrii (v němčině)
 1969: Gohde – patent
 1969: Van Dilla – druhý článek o fluorescenční průtokové cytometrii
 1969: Mullaney – první článek věnující se popisu rozptylu světla jako cytometrického
parametru
 1969: Heryenberg – třetí článek o fluorescenční průtokové cytometrii
 1973: Gohde – patent dvojího značení
 1977: Gohde – popis kompenzací signálu při dvojtém značení
 1978: Kachel – flow imaging – kombinace průtokové cytometrie a analýzy obrazu
 1983: izolace a detekce jader (DNA) z tkání zalitých v parafínu
 1984: kongres o nomenklatuře cytometrie DNA
 1987: Graz - vysokorychlostní sortrování chromozómů
 1991: Robinson – automatizace klinických systémů – průtokový cytometr a čtečka
čárkových kódů
Zdroj – ISAC 2006 –The Wall of History
K čemu to všechno je… například…
K čemu to všechno je… například…
 43 miliónů lidí na světě je infikováno virem HIV (WHO)
 ročně zemře ~ 2 miliónu lidí na HIV/AIDS (v Africe je ~ 11 miliónu AIDS sirotků)
 kvantifikace CD4 T lymfocytů je klíčový parametr při monitorování léčby
 Průtoková cytometrie je „zlatý standard“
 Optimalizované postupy a zařízení pro levné (< 3 EUR / vzorek) a rychlé detekce (250
vzorků / den)
 http://www.cytometryforlife.org/
Co tomu předcházelo…
 Rozvoj techniky umožňující rychlou a
reprodukovatelnou detekci cytometrických
parametrů.
 Nové vědecké poznatky vedoucí k definici
vhodných diagnostických markerů.
http://www.isac-net.org/index.php?option=content&task=view&id=498
ISAC presents: Mack Fulwyler Innovator,
Inventor & Pioneer
Shrnutí přednášky
 Úvod do kurzu
 Zdroje literatury
 Historie průtokové cytometrie
 Základní principy
Na konci dnešní přednášky by jste měli:
1. vědět jaké jsou požadavky pro tento kurz
2. znát základní zdroje informací
3. mít stručný přehled o historii průtokové cytometrie
4. orientovat se v některých základních principech průtokové cytometrie
Na konci dnešní přednášky by jste měli:
1. vědět jaké jsou požadavky pro tento kurz
2. znát základní zdroje informací
3. mít stručný přehled o historii průtokové cytometrie
4. orientovat se v některých základních principech průtokové cytometrie
Bi9393 Analytická cytometrie
Lekce 2
Oddělení cytokinetiky
Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i
Královopolská 135
612 65 Brno
e-mail: ksoucek@ibp.cz
tel.: 541 517 166
Karel Souček, Ph.D.
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Principy průtokové cytometrie a
sortrování
 Světlo
 Fluorescence
 Zdroje excitace, optické systémy a
způsoby detekce fluorescence
 Fluidní systémy
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Pojmy
Fotometrie:
 Světlo – elektromagnetické záření viditelné lidským okem (400-750
nm, nejcitlivější ~ 550 nm). Při měření pod 400 nm (UV, IF) se v
podstatě detekci záření (radiometrie).
 Energie záření se vyjadřuje v joulech
 Světelný tok (radiant flux) je udávána jako hodnota energie v čase ve
wattech (1 watt= 1 joule/sekundu)
 foton – elementární částice. Popisuje je jejich vlnová délka, frekvence,
energie a hybnost. Životnost fotonu je nekonečná (přesto vznikají a
zanikají), existují pouze v pohybu. Má nulovou klidovou hmotnost, ale
nenulovou energii, definovanou vztahem E = hν, kde h je Planckova
konstanta a ν frekvence. Neboť má energii, působí na něj gravitace dle
obecné teorie relativity a on sám gravitačně působí na okolí.
(http://cs.wikipedia.org/wiki/Foton)
 Energie fotonu je vyjádřena jako E=h a E=hc/ [-frequency (Hz), c –
rychlost světla (3x108 m/s), -wavelength (nm), h-Planckova konstanta
(6.63 x 10-34 J/s)]
 Energie je vyšší při kratších vlnových délkách a nižší při delších
vlnových délkách.
488 x 10-3
Laser power
 One photon from a 488 nm argon laser has an
energy of
E= 6.63x10-34 joule-seconds x 3x108
 To get 1 joule out of a 488 nm laser you need
2.45 x 1018 photons
 1 watt (W) = 1 joule/second a 10 mW laser at
488 nm is putting out 2.45x1016 photons/sec
E=h and E=hc/
= 4.08x10-19 J
3rd
Ed. Shapiro p 77
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
325 x 10-3
What about a UV laser?
E= 6.63x10-34 joule-seconds x 3x108
= 6.12 x 10-19 J so 1 Joule at 325 nm = 1.63x1018 photons
What about a He-Ne laser?
633 x 10-3
E= 6.63x10-34 joule-seconds x 3x108
= 3.14 x 10-19 J so 1 Joule at 633 nm = 3.18x1018 photons
3rd Ed. Shapiro p 77
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Polarization and Phase: Interference
 Electric and magnetic fields
are vectors - i.e. they have
both magnitude and direction
 The inverse of the period
(wavelength) is the frequency
in Hz
3rd Ed. Shapiro p 78
Wavelength (period T)
Axis of
Magnetic Field
Axis of Propagation
AxisofElectricField
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Interference
Constructive
Interference
Destructive
Interference
A
B
C
D
A+B
C+D
Amplitude
0o 90o 180o 270o 360o Wavelength
Figure modified from Shapiro “Practical Flow
Cytometry” Wiley-Liss, p79
Here we have a phase difference of
180o (2 radians) so the waves
cancel each other out
The frequency does
not change, but the
amplitude is doubled
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Rozptyl světla
 Hmota rozptyluje světlo vlnových délek které není
schopna absorbovat
 Viditelné spektrum je 350-850 nm proto malé
částice a molekuly (< 1/10 ) spíše viditelné světlo
rozptylují
 Pro malé částice byl popsán tzv. Rayleightův
rozptyl (scatter) jehož intenzita je ~ stejná všemi
směry
 Rozptyl větších částic charakterizuje tzv. Mieův
rozptyl. Jeho množství je větší ve směru v jakém
dopadá světlo na ozářenou částici  na tomto
principu je založeno měření velikosti částic pomocí
průtokového cytometru
Shapiro p.106Shapiro p.106http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/atmos/blusky.html
Rayleightův a Mieův rozptyl
 Rayleightův rozptyl – molekuly a
velmi malé částice neabsorbují,
ale rozptylují světlo které má
menší vlnovou délku než je
jejich velikost (modré nebe vzduch
rozptyluje lépe kratší
vlnové délky)
 Mieův rozptyl je charakteristický
pro částice větší než je vlnová
délka světla (bílá záře kolem
slunečního kotouče, mlžné
světlo)
kj
kj
http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/atmos/blusky.html
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Odraz a lom
Snellův zákon
 Při šíření záření z prostředí
opticky řidšího do opticky
hustšího prostředí se
paprsky lámou směrem ke
kolmici.
 Při šíření záření z prostředí
opticky hustšího do opticky
řidšího prostředí se
paprsky lámou směrem od
kolmice.
Shapiro p 106Shapiro p 106
t
i
r
Incident Beam
Reflected Beam
Transmitted
(refracted)Beam
n1 sin Øi = n2 sin Øt
Látka index lomu
Vzduch
(normální tlak) 1,0003
led 1,31
voda 1,33
etanol 1,36
sklo 1,5 až 1,9
sůl 1,52
safír 1,77
diamant 2,42
Brewster’s Angle
Photo ©2000 – J.P. Robinson
http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Brewsters-angle.png
Polarizační úhel – úhel dopadu při
kterém částečně polarizované světlo
prochází povrchem bez odrazu.
Ohyb a rozklad světla
rozklad
Krátké vlnové délky jsou
“ohnuty” více než dlouhé
kj
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
© Microsoft Corp, 1995
Electromagnetic Spectrum
Only a very small region within the ES
is used for flow cytometry applications
© J. P. Robinson, Purdue University
George Gabriel Stokes (1819 – 1903)
Anglický fyzik a matematik
působící na univerzitě v Cambridge
http://www.nndb.com/people/131/000097837/
1852 – popsal fluorescenci
Název vznikl z anglického slova fluospar
(fluorit, kazivec = nerost CaF2)
- ke svému pozorování použil roztok chininu,
jako zdroj světla sluneční paprsky, jako
excitační filtr sloužilo tmavě modré okenní
sklo a jako emisní filtr byla použita sklenice
bílého vína
G. C. Stokes „On the Change of Refrangibility of
Light“ Philosophical Transactions of the Royal
Society of London, 1852, vol. 142, p. 463.)
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Princip fluorescence
Fluorescence je výsledek tří fázového u jevu některých chemickýc látek fluorochromů,
fluorescenčních barev. Fluorescenční značka (próba) -fluorochrom
schopný lokalizace do určitého bilologockého vzorku nebo odpovídat na specifický
podnět. Stage 1 : Excitation
A photon of energy hvEX is supplied by an external source such as an incandescent lamp
or a laser and absorbed by the fluorophore, creating an excited electronic singlet state
(S1'). This process distinguishes fluorescence from chemiluminescence, in which the
excited state is populated by a chemical reaction.
Stage 2 : Excited-State Lifetime
The excited state exists for a finite time (typically 1–10 10-9 seconds). During this time, the
fluorophore undergoes conformational changes and is also subject to a multitude of
possible interactions with its molecular environment. These processes have two important
consequences. First, the energy of S1' is partially dissipated, yielding a relaxed singlet
excited state (S1) from which fluorescence emission originates. Second, not all the
molecules initially excited by absorption (Stage 1) return to the ground state (S0) by
fluorescence emission. Other processes such as collisional quenching, fluorescence
energy transfer and intersystem crossing (see below) may also depopulate S1. The
fluorescence quantum yield, which is the ratio of the number of fluorescence photons
emitted (Stage 3) to the number of photons absorbed (Stage 1), is a measure of the
relative extent to which these processes occur.
Stage 3 : Fluorescence Emission
A photon of energy hvEM is emitted, returning the fluorophore to its ground state S0. Due
to energy dissipation during the excited-state lifetime, the energy of this photon is lower,
and therefore of longer wavelength, than the excitation photon hvEX. The difference in
energy or wavelength represented by (hvEX–hvEM) is called the Stokes shift. The Stokes
shift is fundamental to the sensitivity of fluorescence techniques because it allows
emission photons to be detected against a low background, isolated from excitation
photons. In contrast, absorption spectrophotometry requires measurement of transmitted
light relative to high incident light levels
at the same wavelength.
Jablonski diagram illustrating the processes
involved in the creation of an excited
electronic singlet state by optical
absorption and subsequent emission of
fluorescence. The labeled stages 1, 2, 3 are
referred to in the text.
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Fluorescenční spektra
Fluorescenční proces je cyklický.
Kromě fluorochromu nevratně zničeného (photobleaching - „vysvícení“) může být
opakovaně excitován.
Excitation of a fluorophore at three different wavelengths (EX 1, EX
2, EX 3) does not change the emission profile but does produce
variations in fluorescenceemission intensity (EM 1, EM 2, EM 3) that
correspond to the amplitude of the excitation spectrum.
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Detekce fluorescence
Vybavení pro fluorescenci
(1) zdroj excitace
(2) fluorochrom
(3) vlnové filtry pro izolaci emitovaných fotonů od excitovaných
(4) detektory pro registraci emitovaných fotonů
Fluorescenční přístroje
- spektrofluorometer měří průměrné vlastnosti objemu vzorku v kyvetě.
- fluorescenční mikroskop popisuje fluorescenci jako jev v prostorovém systému souřadnic
- flow cytometer měří fluorescenci v proudícím toku, umožňuje detekovat a kvantivikovat
subpopulace uvnitř velkého vzorku
Fluorescenční signál
- spektrofluorometer je flexibilní, umožňuje měřit
v kontinuálním spektru excitačních a emisních
vlnových délek
- flow cytometr potřebuje fluorescenční značky
excitovatelné
určitou vlnovou délkou.
Fluorescence pozadí
- endogení složky - autofluorescence
- nenávazané nebo nespecificky vázané značky
= reagenční pozadí
Vícebarevné značení
- dvě a více značek, zároveň monitoruje různé funkce
- nutné: vhodně zvolit značky zdroj excitace a separační filtry
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Fluorescence Output of Fluorophores
Comparing Different Dyes
F-actin ~
BODIPY FL phallacidin
anti-ß tubulin ~
Texas Red
goat anti–mouse IgG
DNA ~
DAPI
Mouse 3T3
 Hind III
POPO-1
BOBO-1YOYO-1TOTO-1
JOJO-1
POPO-3LOLO-1
BOBO-3
YOYO-3TOTO-3
propidium iodide
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Table of Fluorochromes
http://pingu.salk.edu/fcm/fluo.html
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Create Your Virtual Cell
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Res
earch-Tools/Cell-Staining-Tool.html
Procesy interferující a detekcí
fluorescence
 Quenching - „zhášení“ fluorescence pomocí polárních
rozpouštědel, těžkých iontů.
 Bleaching – změna struktury fluorescenční
molekuly vedoucí ke ztrátě fluorescence (působením
světla a nebo chemickou interakcí.
 Photon saturation – stav kdy množství molekul
v excitovaném stavu odpovídá množství molekul v
bazální hladině
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Photobleaching
- irreversible destruction or photobleaching of the excited fluorophore
Oregon Green 514 goat anti–mouse IgG
fluorescein goat anti–mouse IgG
anti–human cytochrome oxidase subunit I
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Základ průtokové cytometrieZáklad průtokové cytometrie
Buňky v suspenzi
protékají jednotlivě napříč
osvětlenou částí kde
rozptylují světlo a emitují
fluorescenci,
která je detekována, filtrována a
převedena na digitální hodnoty
uložené do počítače
FluidicsFluidics
OpticsOptics
ElectronicsElectronics
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Optika - zdroj světlaOptika - zdroj světla
•• nutnost zaostřit zdroj světla na stejné místo, kde je zaostřen pnutnost zaostřit zdroj světla na stejné místo, kde je zaostřen průtok buněkrůtok buněk
•• LaseryLasery
•• produkují jednotlivou vlnovou délku světla (325, 488,produkují jednotlivou vlnovou délku světla (325, 488, ~~63630nm)0nm)
•• poskytujíposkytují mWmW -- W světlaW světla
•• mohou býtmohou být ““levnélevné”” -- airair--cooledcooled , nebo drahé, nebo drahé -- waterwater--cooledcooled
•• poskytují koherentní světelný proudposkytují koherentní světelný proud
•• Obloukové lampy (Obloukové lampy (ArcArc--lampslamps))
•• produkujíprodukují směssměs vlnových délek, které musí být filtroványvlnových délek, které musí být filtrovány
•• poskytujíposkytují mWmW světlasvětla
•• levnélevné -- airair--cooledcooled
•• nekoherentní světelný proudnekoherentní světelný proud
- optické kanály- optické kanály
•• cesta světla z místa ozáření buněk k detektorucesta světla z místa ozáření buněk k detektoru
•• optické částioptické části separujíseparují určité vlnové délkyurčité vlnové délky
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
LASER(y)
- koherentní (souvislý světelný tok)
- monochromatický
- soustředěný
http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/hframe.html
http://www.ilt.fraunhofer.de/eng/100053.html
http://en.wikipedia.org/wiki/Helium-neon_laser
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
LASER vs. Arc lamp
http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Helium_neon_laser_spectrum.png
H.M. Shapiro, Practical Flow Cytometry, 4th ed.
http://en.wikipedia.org/wiki/Helium-neon_laser
http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/sources.html
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Optika - „Forward Scatter“ kanálOptika - „Forward Scatter“ kanál
•• ččást světla rozptýlená ve stejné oseást světla rozptýlená ve stejné ose
jako je směr světelného paprskujako je směr světelného paprsku
•• intenzita „intenzita „forwardforward scatteruscatteru““
odpovídáodpovídá velikosti, tvaru a optickévelikosti, tvaru a optické
homogenitěhomogenitě buněkbuněk
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Forward Angle Light Scatter
FALS
Sensor
Laser
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Optika - „Side Scatter“ kanálOptika - „Side Scatter“ kanál
•• ččást světla rozptýlená kolmo do strany odást světla rozptýlená kolmo do strany od
osy směru světelného paprskuosy směru světelného paprsku sideside (90(90oo
))
scatterscatter channelchannel
•• intenzita „intenzita „sideside scatteruscatteru“ odpovídá“ odpovídá velikosti,velikosti,
tvaru a optické homogenitětvaru a optické homogenitě buněkbuněk
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
90 Degree Light Scatter
FALS Sensor
90LS Sensor
Laser
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Optika - Light ScatterOptika - Light Scatter
•• „„ForwardForward scatterscatter“ zachycuje“ zachycuje povrchovépovrchové
vlastnosti a velikostvlastnosti a velikost částicčástic
•• může být použit k rozlišení živých amůže být použit k rozlišení živých a
mrtvých buněkmrtvých buněk
•• „„SideSide scatterscatter“ odpovídá“ odpovídá inkluzíminkluzím uvnitřuvnitř
buněkbuněk
•• možno odlišitmožno odlišit granulárnígranulární aa negranulárnínegranulární
populacipopulaci
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Optika - fluorescenční kanályOptika - fluorescenční kanály
•• fluorescence emitovaná z každéhofluorescence emitovaná z každého
fluorochromufluorochromu je detekována pomocíje detekována pomocí
specifickéhospecifického fluorescenčního kanálufluorescenčního kanálu
•• specifitaspecifita detekce je kontrolovánadetekce je kontrolována
vlnovou selektivitou filtru a zrcadelvlnovou selektivitou filtru a zrcadel
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Laser
Fluorescence Detectors
Freq
Fluorescence
FALS Sensor
Fluorescence detector
(PMT3, PMT4 etc.)
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Optika - vlastnosti filtrůOptika - vlastnosti filtrů
•• jsou konstruovány z materiálůjsou konstruovány z materiálů
absorbujících určitou vlnovou délkuabsorbujících určitou vlnovou délku
(a propouštějí jinou)(a propouštějí jinou)
•• přechod mezipřechod mezi absorbancíabsorbancí a transmisía transmisí
není přesný; nutné specifikovat lomnení přesný; nutné specifikovat lom
světla při konstrukci filtrusvětla při konstrukci filtru
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Optics - vlastnosti filtrůOptics - vlastnosti filtrů
•• „„LongLong passpass“ filtr“ filtr propouští vlnovoupropouští vlnovou
délkudélku nadnad „řezanou“ délkou„řezanou“ délkou
•• „„ShortShort passpass“ filtr“ filtr propouští vlnovoupropouští vlnovou
délkudélku podpod „řezanou“ délkou„řezanou“ délkou
•• „Band„Band passpass“ filtr“ filtr propouští vlnovoupropouští vlnovou
délku vdélku v úzkém rozmezíúzkém rozmezí okolookolo
specifické vlnové délkyspecifické vlnové délky
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Standard Long Pass FiltersStandardStandard LongLong PassPass FiltersFilters
TransmittedTransmitted LightLightLightLight SourceSource
520520 nmnm LongLong PassPass FilterFilter
>520>520 nmnm
LightLight
TransmittedTransmitted LightLightLightLight SourceSource
575575 nmnm ShortShort PassPass FilterFilter
<575<575 nmnm
LightLight
Standard Short Pass FiltersStandardStandard ShortShort PassPass FiltersFilters
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Standard BandStandard Band PassPass FiltersFilters
Transmitted LightWhite Light Source
630 nm BandPass Filter
620 -640 nm Light
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Optika - vlastnosti filtrůOptika - vlastnosti filtrů
•• pokud je filtr umístěn vpokud je filtr umístěn v 4545oo
úhluúhlu keke
zdroji světla, světlo, které má projítzdroji světla, světlo, které má projít
tak projde, ale blokované světlo jetak projde, ale blokované světlo je
odraženo v 90odraženo v 90oo
úhluúhlu
•• dichroickédichroické filtry,filtry, dichroickádichroická zrcadlazrcadla
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Dichroic Filter/MirrorDichroic Filter/Mirror
Filter placed at 45o
Reflected light
Transmitted LightLight Source
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Optika - uspořádání filtrůOptika - uspořádání filtrů
•• k společnému měření více nežk společnému měření více než
jednoho „jednoho „scatteruscatteru“ nebo“ nebo
fluorescence , používámefluorescence , používáme
mnohonásobné kanálymnohonásobné kanály (a detektory)(a detektory)
•• multikanálovémultikanálové uspořádání musíuspořádání musí
splňovatsplňovat
•• spektrální vlastnostispektrální vlastnosti použitéhopoužitého
fluorochromufluorochromu
•• správný řád uspořádánísprávný řád uspořádání filtrů a zrcadelfiltrů a zrcadel
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Optika - detektoryOptika - detektory
•• dva obecné typy detektorůdva obecné typy detektorů
• fotodioda
•• používá se pro silný signál (používá se pro silný signál (forwardforward scatterscatter
detectordetector))
•• fotonásobičfotonásobič ((photomultiplierphotomultiplier tubetube -- PMT)PMT)
•• citlivější nežcitlivější než fotodiodafotodioda, muže být poškozen, muže být poškozen
přesvícenímpřesvícením
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
Photomultiplier tubes (photomultipliers, PMTs)
http://en.wikipedia.org/wiki/Photomultiplier
Základní charakteristika:
-vysoce citlivé detektory (jeden foton)
-velké zesílení signálu/nízký šum
-velká plocha detekce
-rychlá frekvence odpovědi
-velké pracovní napětí (1000 – 2000 V)
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Fotodioda
Porovnání s PMT
Výhody:
1. excelentní linearita signálu
2. rozsah spektrální detekce 190 nm to 1100 nm (silicon)
3. nízký šum
4. Odolnost vůči mechanickým vlivům
5. nízká cena
6. malá velikost a hmotnost
7. dlouhá životnost
8. Vysoká kvantová účinnost (~80%)
9. Nepotřebuje vysoká napětí
Nevýhody
1. Malá plocha
2. Nemožnost integrálního zesílení
3. Mnohem nižní citlivost
4. Počítání fotonů pouze u speciálních produktů
5. Kratší čas odpovědi
http://en.wikipedia.org/wiki/Photodiode
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
PMT
PMT
PMT
PMT
Dichroic
Filters
Bandpass
Filters
Example Channel Layout for Laserbased
Flow Cytometry
Laser
1
2
3
4
Flow cell
original from Purdue University Cytometry Laboratories; modified by R.F. Murphy
BD FACSCalibur system
http://www.bdbiosciences.com/immunocytometry_systems/
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
BD LSR II system
http://jcsmr.anu.edu.au/facslab/facs/LSR2.html
Aria II
EthidiumEthidium
PEPE
ciscis--ParinaricParinaric acidacid
TexasTexas RedRed
PEPE--TRTR ConjConj..
PIPI
FITCFITC
600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm
457350 514 610 632488Common
Laser
Lines
Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Octagon Detection System
SSC
PE
PE-Cy7
FITC
PerCP-Cy5.5
695/40
655 LP
PE-TxRed
610/20
565
LP
575/26
556LP
488/10
530/30
502LP
“kostka” pro konvenční
fluorescenční mikroskop
Acousto Optical Beam Splitter AOBS®
Acousto Optical Beam Splitter
AOBS®
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/filters/aotf/index.html
http://simple.wikipedia.org/wiki/Tellurium
Supercontinuum Generation
-a nonlinear process for strong spectral broadening of light
The benefits of AOBS®
•Adaptable to any new dye
•8 lines simultaneously
•Reflected light imaging
•High transmission
•Truly confocal – real optical sectioning
•Fast switching
•Freely tunable
•Fluorescence correlation spectroscopy
with multi-line lasers
http://www.bdbiosciences.com/spectra/
Fluorescence Spectrum Viewer
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Fluidics Cart Cytometer
Fluidní systém: BD FACSAria II
AIR
PRESSURE
BULK
INJECTION
Sheath Tank
AIR
PRESSURE
ASPIRATED
WASTE
(VACUUM)
ASPIRATED
WASTE
(DEGAS)
SHEATH
FILTER
0” – 9”
R1
Sheath Regulator
R2
Sample Regulator
V17
V20
V5V6
Hydrodynamic focussing in the
cuvette
Sheath
Sample
Sheath
Sample
Sample
pressure low,
small core
stream. Good
for DNA
analysis
High sample
pressure,
broader core
stream.
Bad for DNA
analysis
Laser Beams
• tlak nosné (oplašťující) kapaliny vede pufr kyvetou a vyšší
tlak ve zkumavce se vzorkem zavádí vzorek do kyvety.
• Princip hydrodynamického zaostření zarovná buňky v
kyvetě „jako perly na šňůrce“ předtím než dojdou do bodu
kde protnout paprsek laseru.
•Hydrodynamické zaostření nemůže oddělit buněčné
agregáty. Průtoková cytometrie vyžaduje suspenzi
jednotlivých buněk!
Fluidika – shrnutí 2
Shrnutí přednášky
 Světlo
 Fluorescence
 Zdroje světla a optické systémy průtokového
cytometru
 Fluidní systémy
Na konci dnešní přednášky by jste měli:
1. znát základní principy rozptylu světla a
2. fluorescence;
3. vědět jaké zdroje světla se využívají v průtokové cytometrii;
4. a jakým způsobem je detekováno;
5. znát základní principy fluidních systémů a laminárního proudění.
Na konci dnešní přednášky by jste měli:
1. znát základní principy rozptylu světla a
2. fluorescence;
3. vědět jaké zdroje světla se využívají v průtokové cytometrii;
4. a jakým způsobem je detekováno;
5. znát základní principy fluidních systémů a laminárního proudění.
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Bi9393 Analytická cytometrie
Lekce 3
Oddělení cytokinetiky
Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i.
Královopolská 135
612 65 Brno
e-mail: ksoucek@ibp.cz
tel.: 541 517 166
Karel Souček, Ph.D.
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Image Stream & Flowsight Amnis –
kombinace průtokové cytometrie a analýzy
obrazu
Amnis - aplikace
Principy průtokové cytometrie a
sortrování
 sorting
 zpracování signálu
 analýza dat
 kompenzace signálu
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
+++++
-----
+++++
-----
+++++
-----
+++++
+++++-----
+++++
++
+++++-----
+++++
++
+++++
+
+++++-----
+++++
+
+++++
-----
+++++-----
++++++++++
-----
+++++----- ++++++++++
-----
- -
+++++-----
- - - - -
-
- - - - -
-
+++++-----
-
- - - - - - - - -
-
+++++-----
- - - - - - - - - -
-
+++++-----
- - - - -- - - - -
+++++-----
- - - - - - - - - -
SORTING
Frequency
Charge
Drop Delay
Amplitude
SORTING
SORTING
Sheath Pressure
Nozzle SizeFrequency
Amplitude
SORTING
Drop delay
Interrogation
point
Breakoff
SORTING
Sort
Setup
mode
Default
Sheath
Pressure
70 micron
70 custom
70 psi
85 micron
85 custom
45 psi
100 micron
100 custom
20 psi
130 micron
130 custom
10 psi
SORTING
Each sort setup includes:
Sheath pressure
Breakoff window values
Side Stream window
values
Instrument window >
Laser tab values
SORTING - Streams
Good Bad
SORTING – Setup Side Streams
Drop Delay interrogation
point
drop delay
breakoff
WasteWaste
BD FACS™
Accudrop
technology
 Accudrop beads
 Diode laser
 Camera
 Optical filter
Sorting - Sort Masks
Cells are randomized
distributed over the stream
Sorting - Sort Masks
Trailing
Interrogated
Leading
Mask
 A region of the stream monitored for the
presence of cells
 Determines how drops will be deflected if a
sorting conflict occurs
 Measured in 1/32 drop increments
Mask = 0 Mask = 8 Mask = 16 Mask = 32
4
4
8
8
16
16
Conflict Resolution
 Precision modes include three types of
masks
– Yield
– Purity
– Phase
Sorting - Sort Masks
Sort decisions are determined by sort masks
Target particles in a drop with
1/32-drop resolution
Sorting - Yield Mask
The yield mask defines how many drops will be sorted Yield mask of
8/32 indicated in blue; target particle shown in green
Yield Mask
Sorting - Purity Mask
Purity mask of 8/32 in blue, 4/32 in each adjacent drop;
target particles in green, non-target particles in red
Purity Mask
Purity Mask
LaserLaser
LaserLaser
LaserLaser
Creation of a Voltage Pulse
Time
Voltage
Time
Voltage
Time
Voltage
1
2
3
Height, Area, and Width
Time (µs)
Voltage
Pulse area(A)PulseHeight(H)
Pulse Width
(W)
0
Signal processing
time
analogsignalintesity
VOLTAGE
FSC ~ cell size
FL-1 (530/30nm) ~ green fluo.
FL-2 (585/42nm) ~ red fluo.
Analog/digital
conversion
Height
Width
Area ( ∫ )
FL- (H, W, A)
FL-1(H)
FL-2 (H)
dot plot
0 1000
1000
Zesílení
signálu (!)
lin nebo log
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
24=16
Lineární a logaritmický obvod
 lineární
 logaritmický
 dynamický rozsah
 kompenzace fluorescenčního signálu
Lineární obvody
 výstupní signál odpovídá (poměrově) vstupnímu
signálu
 detekce signálu založeného na kvantitativním vztahu
(DNA značení) vyžaduje 10 bitové rozlišení
 vyšší přesnost vyžaduje vyšší množství bitů
 současná zařízení mají rozlišení 4 řádů v logaritmické
škále - ADC musí mít schopnost rozlišení nejméně
1/10,000 což odpovídá 1 mV v 0-10 V škále.
 pro dosažení této přesnosti je nutné 14ti bitové
rozlišení
upraveno podle J.P.Robinson
AD převodníky
Počet bitů # kanálů rozlišení
8 256 39.1 mV
10 1024 9.77 mV
12 4096 2.44 mV
14 16384 610 V
16 65536 153 V
18 262144 38.1 V
20 1048576 9.54 V
22 4194304 2.38 V
24 16777216 596 nV
28 = 256
210 = 1024
.
.
.
Full scale measurement range = 0 to 10 volts
ADC resolution is 12 bits: 212 = 4096 quantization levels
ADC voltage resolution is: (10-0)/4096 = 0.00244 volts = 2.44 mV
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Proč používat lineární obvody?
 Kompenzace signálu musí být prováděny na
lineárních datech. Tzn. že celá elektronika
musí být lineární (> 14-ti bit ADC) nebo musí
být doplněn speciální obvod mezi
předzesilovač a display.
 Pro imunologické fenotypizace potřebujeme
velký dynamický rozsah.
 průtokový cytometr zesiluje signál na hodnoty
mezi 0-10 V před ADC.
upraveno podle J.P.Robinson
Kolik bitů?
 Pokud konvertujeme analogový signál
pomocí 8 bitového ADC – máme 256 kanálů
(28=256) odpovídajících rozsahu 0-10 V
 Rozdíl mezi kanály je 10/256=~40mV
0 50 100 150 200 250
10V1V
100mV
Channels
upraveno podle J.P.Robinson
Ideální logaritmický zesilovač
0 50 100 150 200 250
10 V1 V
100 mV
0 50 100 150 200 250
10 V1 mV
Channels
Linearní
Log
1 V100 mV10 mVLog amp
upraveno podle J.P.Robinson
Logaritmické zesílení & dynamický rozsah
upraveno podle J.P.Robinson
lin
log
„Ratio circuits“
 jsou analogové obvody generující výstupní signál
odpovídající poměru ze dvou vstupních signálu (dvou
detektorů)
 Tvořeno speciálními moduly tzv. analogové násobiče.
 např. pro výpočet povrchové denzity navázaných
antigenů dělíme počet navázaných molekul velikostí
povrchu buněk (není běžné)
 Detekce intracelulárního pH
 Detekce intracelulárních Ca2+ (Indo-1)
 lze také kalkulovat pomocí speciálních softwarových
nástrojů
upraveno podle J.P.Robinson
Kompenzace fluorescenčního
signálu
…později
 přesnost – koeficient variance (CV)
 citlivost, šum, pozadí
 MESF jednotky
 Přesnost a linearita
Koeficient variance
Klíčové pro jeho hodnotu je:
• stabilita fluidního systému
• obarvení (označení) buněk
průměr
CV=3.0
CV=3.0
%CV definice = St.chyba x 100
průměr
upraveno podle J.P.Robinson
Kvantitativní jednotky - ABC
Antibody Binding Capacity
 množství protilátky, které se specificky váže
na populaci buněk (nebo mikročástic)
 pozn.: Hodnota ABC nemusí odpovídat
skutečnému množství antigenů na povrchu
buněk nebo částic
upraveno podle J.P.Robinson
0 50 100 150 200 250
1
10
100
1,000
10,000
100,000
1,000,000
Histogram Channel
AntibodyBindingCapacity
Mean
98%
Detekce prahu (šumu)
Slide from Dr. Abe Schwartz
upraveno podle J.P.Robinson
Určení ABC
ABC
Proč je důležité určit práh?
 určuje nejnižší množství značky
(protilátky) detekovatelné přístrojem
 určí, zda pozadí (šum) interferuje s
analýzou
Dako Cytomation
MEFS Units
 Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome
(MESF) Units
– metoda pro určení citlivosti přístroje (Abraham Schwartz)
– směs částic označených známým množstvím molekul
fluorescenční značky
– práh určený pomocí MESF znamená nejmenší
detekovatelné množství fluorochromu (BD FACS Aria II 85
MEFS – FITC)
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Linearita detekce
 praktický příklad nelinearity může být během
měření množství DNA v buňkách v G0/G1 a
G2/M fázi buněčného cyklu
 lze použít mikročástice nebo jiné vnitřní standardy
pro kalibraci
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Analýza dat
 Zobrazení dat
– histogram
– dot plot
– isometric display
– contour plot
– chromatic (color) plots
– 3 D projection
 Gating
Způsoby pro zobrazení dat
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Histogram distribuce četnosti
 Histogram zobrazuje četnost částic pro jeden parametr
 Jednoduchý výstup
 Nekorelujeme s dalším parametrem
 Problém s identifikací populací
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Dot plot
 Zobrazuje korelaci dvou libovolných parametrů
 Jednotlivé tečky představují konkrétní změřené buňky (částice)
 Hodnoty pro řadu částic mohou ležet ve stejném místě
 Nemáme informaci o relativní denzitě částic
 Problémy s vykreslením v případě velkých objemů dat
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Density & contour plot
Density plot:
 Zobrazuje dva parametry jako frekvenci četnosti
 barva a nebo její odstín odpovídá četnosti částic
Contour plot:
 spojnice spojuje body (částice) se stejnou
hodnotou signálu
 V podstatě simulujeme 3D graf – třetí rozměr je
frekvence
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Čas jako jeden z parametrů
R1
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
3D zobrazení
 2 parametry + četnost
 3 parametry společně
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
3 Color Combinations
Negatives
Positives
4+4=8
FITC
PEA
PC 4+4+4=12
upraveno podle J.P.Robinson
3 Color Combinations
FITC
PEA
PC 4+4+4=12
PE-FITC Pattern
FITCFITC
TR-FITC Pattern
FITCFITC
TR-PE Pattern
PhycoerytherinPhycoerytherin
.1.111010010010001000
.1.111101010010010001000
.1.111101010010010001000
.1.1 11 1010 100100 10001000 .1.1 11 1010 100100 10001000 .1.1 11 1010 100100 10001000
CD4CD4
CD5
CD5 CD38CD38
K/LK/L
CD45CD45
CD3CD3
NegativeNegative NegativeNegative
CD10
CD10
HLA
HLA--DRDR
CD20CD20
CD8CD8
CD7CD7
CD2CD2
CD8CD8
CD8 (dim)CD8 (dim)
CD2CD2
NegativeNegative CD4CD4 CD5CD5
KK
TexasRedTexasRed
TexasRedTexasRed
PhycoerytherinPhycoerytherin
CD3CD3
CD3CD3
IgMIgM
IgGIgG
CD3CD3
CD8CD8
CD3CD3
CD20CD20
IgGIgG
LL
CD20CD20
CD20CD20
CD45CD45
upraveno podle J.P.Robinson
„Gating“
Real-time gating vs. softwarový
„gating“
Určení regionů
Strategie „gatingu“
Analýza kvadrantů
Boolean „gating“
zpětný „gating“
Real-Time vs. Software Gating
Real-time (live) gating:
-omezuje akceptovaná data během
měření
Software (analysis) gating:
-vyřazuje určitá data během následné
analýzy
upraveno podle J.P.Robinson
Určení regionů
Objektivní nebo subjektivní?
-školení/schopnosti/trénink
Možné tvary:
-obdelník
-elipsa
-“free-hand“ (polygon)
-kvadrant
Statistika
- počet
- podíl (%)
- průměr, medián, S.D., CV, ….
Region vs. gate
Region
oblast (plocha) v grafu definovaná
uživatelem
mnoho regionů v jednou grafu
ohraničujeme pomocí nich populace našeho
zájmu
je možné je barevně odlišit
je definován stejně pro všechny vzorky v
analýze
Gate
je definován jako jeden a nebo více regionů
zkombinovaných pomocí logických operátorů
(AND, OR, NOT; Booleova logika)
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Region 1 establishedRegion 1 established Gated on Region 1Gated on Region 1
Using GatesUsing Gates
logPE
upraveno podle J.P.Robinson
Statistika
 Aritmerický průměr
 Geometrický průměr
 Medián
– odhad střední hodnoty
– není ovlivněn extrémními hodnotami
 Směrodatná odchylka
 Koeficient variance
 Modus – nejčastější hodnota
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Statistika pro histogram
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Analýza kvadrantů
(+ +)( - +)
(+ -)(- -)
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Logický „Gating“ (Booleova logika)
S překrývajícími se oblastmi máme mnoho možností:
upraveno podle J.P.Robinson
Boolean GatingBoolean Gating
Not Region 1:Not Region 1:
upraveno podle J.P.Robinson
Boolean GatingBoolean Gating
Not Region 2:Not Region 2:
upraveno podle J.P.Robinson
Boolean GatingBoolean Gating
Region 1 or Region 2:Region 1 or Region 2:
upraveno podle J.P.Robinson
Boolean Gating
Region 1 and Region 2:Region 1 and Region 2:
upraveno podle J.P.Robinson
Not (Region1 and Region 2):Not (Region1 and Region 2):
Boolean Gating
upraveno podle J.P.Robinson
90 Degree Scatter
0 200 400 600 800 1000
ForwardScatter
02004006008001000
8
15
20
30
40
50
100
200
1000
Lymphocytes
Monocytes
Neutrophils
Side Scatter Projection
ForwardScatterProjection
Light Scatter Gating
Scale
upraveno podle J.P.Robinson
Back Gating
Region 4 establishedRegion 4 established BackBack--gating using Region 4gating using Region 4
logPE
Back gateBack gate
upraveno podle J.P.Robinson
Back Gating
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
FITC+
PE+
FITC+
APC+
PE +
APC+
3 Parameter Data Display
upraveno podle J.P.Robinson
Vícebarevné analýzy generují
mnoho dat…
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
3 color
4 color 5 color
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
Log Fluorescence
QUADSTATS
LogFluorescence
++
-- +-
-+
upraveno podle J.P.Robinson
Způsoby pomocí kterých lze upravit
výsledky:
1. Odstranění „doublets“
2. Čas jako parametr pro kontrolu kvality
Příklad - pro DNA analýzu je třeba:
- odstranit „debris“ a shluky
- odstranit „doublets“
- udržovat konstantní průtok
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
DNA Histogram
G0-G1
S
G2-M
Fluorescence Intensity
#ofEvents
Co je problém při vícebarevné
detekci?
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Emission Spectra–Spectral
Overlap
Kompenzace fluorescenčního
signálu při vícebarevné detekci
 Proces při kterém dochází k eliminaci
všech fluorescenčních signálů kromě
signálu z fluorochromu který má být na
příslušném detektoru detekován
 Nastavení pomocí mixu mikročástic či
buněk označených/neoznačených
příslušnými fluorochromy.
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Kompenzace fluorescenčního
signálu při vícebarevné detekci
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
Kompenzace fluorescenčního
signálu
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
FITC positive &
negative
PE negative beads#2
Kompenzace fluorescenčního
signálu
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
FITC positive &
negative
PE negative beads
NONE!
Kompenzace fluorescenčního
signálu
Nastavení kompenzací
parametr - detektor amp.
FL1 - 544
FL2 - 434
kompenzace
FL1 - 1.1%FL2
FL2 - 17.5%FL1
 značené mikročástice – pro běžně konjugované fluorochromy
 značené buňky – pro vitální značení
Which marker for compensation?
Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large
compensation errors with bright reagents (B & C).
Use bright markers to setup proper compensation.
Kompenzace - literatura
Mario Roederer - Compensation in Flow Cytometry
Current Protocols in Cytometry (2002) 1.14.1-1.14.20 John Wiley & Sons, Inc.
M. Loken, D. R. Parks, & L. A. Herzenberg (1977). Two-color
immunofluorescence using a fluorescence-activated cell sorter. J. Histochem.
Cytochem. 25:899-907.
M. Roederer & R. F. Murphy (1986). Cell-by-cell autofluorescence correction for
low signal-to-noise systems: application to EGF endocytosis by 3T3 fibroblasts.
Cytometry 7:558-565.
S. Alberti, D. R. Parks, & L. A. Herzenberg (1987). A single laser method for
subtraction of cell autofluorescence in flow cytometry. Cytometry 8:114-119.
C. B. Bagwell & E. G. Adams (1993). Fluorescence spectral overlap
compensation for any number of flow cytometry parameters. in: Annals of the
New York Academy of Sciences, 677:167-184.
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie
No Data AnalysisNo Data Analysis
Technique CanTechnique Can MakeMake
Good Data Out ofGood Data Out of
BadBad Data!Data!
Shapiro’s 7th Law of Flow CytometryShapiro’s 7th Law of Flow Cytometry
Shrnutí přednášky
 sorting
 zpracování signálu
 vizualizace dat a „gating“
 kompenzace
Na konci dnešní přednášky by jste měli:
1. Znát základní principu sortování,
2. popsat způsob zpracování signálu,
3. rozumět lin / log zesílení signálu,
4. rozeznat jednotlivé způsoby vizualizace dat,
5. chápat základní principy „gatingu“,
6. znát princip kompenzace signálu při vícebarevné detekci.
Na konci dnešní přednášky by jste měli:
1. Znát základní principu sortování,
2. popsat způsob zpracování signálu,
3. rozumět lin / log zesílení signálu,
4. rozeznat jednotlivé způsoby vizualizace dat,
5. chápat základní principy „gatingu“,
6. znát princip kompenzace signálu při vícebarevné detekci.
K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie