Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 7 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescenční proteiny  bioluminescence resonance energy transfer (BRET) Aequorea victoria - medúza žijící ve vodách na pobřeží Severní Ameriky. – je schopna modře světélkovat (bioluminescence). Ca2+ interaguje s fotoproteinem aequorinem. – modré světlo excituje green fluorescent protein. Renilla reniformis – korál žijící ve vodách na severním pobřeží Floridy. – luminescence vzniká degradací coelenterazinu za katalytického působení luciferázy. – modré světlo excituje green fluorescent protein. Renilla reniformis "Sea Pansy" http://www.mbayaq.org/efc/living_species/default.asp?hOri=1&inhab=440 Aequorea victoria “Crystal jelly “ http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescenční proteiny http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm O2• –O2 H2O2 • OH H2O 4 e– reduction to water e– e– e– e– Not so terribly reactive with most biomolecules Maintained at very low concentration Catalases, peroxidases, GSH, etc… Actually a chemical reductant Not so terribly reactive with most biomolecules Mitochondrial superoxide the major source of active oxygen Maintained at very low concentration Superoxide dismutases Reacts with virtually any molecule at diffusion-limited rates The molecule that makes ionizing radiation toxic Unreactive at STP, but a great electron acceptor Biological activation via radicals, transition metals Generally, radical intermediates are enzyme- bound © Simon Melov DCFH-DA DCFH DCF COOH H Cl O O-C-CH3 O CH3-C-O Cl O COOH H Cl OHHO Cl O COOH H Cl OHO Cl O Fluorescent Hydrolysis Oxidation 2’,7’-dichlorofluorescin 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate 2’,7’-dichlorofluorescein Cellular Esterases H2O2 DCFH-DA DCFH-DA DCFH DCF H O2 2 Lymphocytes Monocytes Neutrophils log FITC Fluorescence . 1 1000100101 0 20 40 60 counts PMA-stimulated PMNControl 80 © J. P. Robinson, Purdue University Fluorescent sensors for detection of H2O2 Variants & fusions  pHyPer-cyto vector  pHyPer-dMito vector – Duplicated mitochondrial targeting sequence (MTS) is fused to the HyPer N-terminus. MTS was derived from the subunit VIII of human cytochrome C oxidase [Rizzuto et al., 1989; Rizzuto et al., 1995].  pHyPer-nuc vector – Three copies of the nuclear localization signal (NLS) fused to the HyPer C-terminus provide for efficient translocation of HyPer to the nuclei of mammalian cells [Fischer-Fantuzzi and Vesco, 1988] „High Throughput Flow Cytometry“  automatizace + robotizace = urychlení a efektivita sběru dat (měření desítky vzorků za hodinu s minimálním zásahem operátora )  využití principu vícebarevné analýzy K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Automatizované systémy měření vzorků Automatický karusel (autosampler) Adaptér pro nasávání vzorků z mikrotitrační desky Automatizovaný „microsampler“ systém K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie The steps in a high-throughput fluorescence-microscopy experiment. Analysis http://www.stanford.edu/group/nolan/ http://proteomics.stanford.edu/nolan/ Garry Nolan Peter Krutzik „Fluorescent cell barcoding“ Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Cytometric bead array (CBA)  Multiplexed Bead-Based Immunoassays  flow cytometry application that allows users to quantify multiple proteins simultaneously Multiplex microsphere‐based flow cytometric platforms for protein analysis and their application in clinical proteomics – from assays to results ELECTROPHORESIS Volume 30, Issue 23, pages 4008-4019, 3 DEC 2009 DOI: 10.1002/elps.200900211 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.200900211/full#fig1 CBA CBA  multiplexing capabilities  speed  incorporation of multiple assay formats  rapid assay development and reasonable cost  automation Biologické aplikace průtokové cytometrie  Cytogenetika – analýza chromozómů • karyotyp • sortrování – chromozómové DNA knihovny – FISH značení (chromosome painting) K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Analýza a sortrování chromozómů Analýza a sortrování chromozómů  synchronizace buněk – zisk metafázních chromozómů (colcemid, hydroxyurea)  izolace chromozómů  značení DAPI nebo Hoechst vs. chromomycin A3 (CA3) nebo mithramycin = celková DNA vs. G/C-bohaté oblasti http://www.scienceclarified.com/Ca-Ch/Chromosome.html http://www.nccr-oncology.ch/scripts/page9243.html Analýza a sortrování chromozómů „Flow karyotype“ http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/ ♂ ♀ Karcinom močového měchýře Sortrování chromozómů Pisum sativum Sortrování chromozómů Vicia faba Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii  ekologie  potravinářství  bioterorismus http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/ Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii  viabilita  metabolické funkce  sortrování  analýza aerosolů (Fluorescence Aerodynamic Particle Sizer (Flaps)) Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii  Sortrování – EPICS + Autoclone® modul Fluorescence Aerodynamic Particle Sizer (Flaps) http://www.dres.dnd.ca/ResearchTech/Products/CB_PRODUCTS/RD98001/index_e.html Průtoková cytometrie kvasinek  buněčné dělení  viabilita  membránový potenciál  respirace  produkce H2O2  citlivost k antibiotikům  separace Saccharomyces cerevisiae http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Budding_yeast_Lifecycle.png http://www.sbs.utexas.edu/mycology/sza_images_SEM.htm Průtoková cytometrie kvasinek Průtoková cytometrie v hydrobiologii  studium pico- a nanofytoplanktonu (< 20 M)  analýza metabolických funkcí planktonu  studium pigmentace (analýza chlorofylu a fykoeritrinu) Průtoková cytometrie v hydrobiologii Průtoková cytometrie v hydrobiologii  analýza DNA http://planktonnet.awi.de/portal.php?pagetitle=assetfactsheet&asset_id=15127 http://www.soes.soton.ac.uk/staff/tt/ Průtoková cytometrie v hydrobiologii http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/sieracki/sierack2.htm http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/chl orophyll-a(MeOH).html Průtoková cytometrie bezobratlých  lze aplikovat běžné metodické přístupy a fluorescenční značky  Příklady aplikací: – buněčný cyklus – cytotoxicita – apoptóza Invertebrate Survival Journal http://www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/uses/insects/index.html ex vivo flow cytometrie - limitace  Ovlivnění některých vlastností buněk (morfologie, exprese znaků);  neumožnuje dlouhodobější studie buněčného metabolismu a buněčných interakcí (komunikace, adheze) v přirozeném tkáňovém mikroprostředí;  další: – nízká citlivost pro detekci vzácných buněčných subpopulací (1-10 buněk/ml ~ 5000 – 50000 buněk v 5 litrech krve dospělého člověka); – časově náročná příprava vzorku (hodiny, dny); – diskontinuita odebíraných vzorků. Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo vizualizace - limitace  Tloušťka tkáně Christ with St. Joseph in the Carpenter's Shop Georges De La Tour, ~ 1640 (Musee du Louvre, Paris). Průchod světla tkání The absorption spectrum of a human hand. The spectrum was recorded with a very sensitive spectrophotometer with the hand in close juxtaposition with the photocathode (unpublished data of Karl H. Norris, from The Science of Photobiology (KC Smith, ed., Plenum Press, 1977; p. 400). Effective penetration depth in breast tissue in vivo flow cytometry – základní principy  Zobrazení buněk přímo v krevním nebo lymfatickém řečišti.  Vizualizace pomocí CCD nebo CMOS kamery po ozáření konvenční mikroskopickou lampou nebo lasery.  Detekce absorbce, fluorescence, Ramanova spektra, fototermálních nebo fotoakustických signálů. Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry in vivo flow cytometry – bez značení  Nahrávka videa pomocí vysokorychlostní CCD nebo CMOS kamery s vysokým rozlišením v režimu propustnosti nebo odrazu.  Příklad: high-speed transmittance digital microscopy (TDM)  Limity: hloubka tkáně.  TDM může sloužit k navedení zdrojů záření pro další analýzu do určené oblasti. Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 photoacoustic and photothermal imaging  The photoacoustic effect was first discovered by Alexander Graham Bell in his search for a means of wireless communication.1 Bell succeeded in transmitting sound with an invention he called the “photophone,” which carried a vocal signal with a beam of sunlight that was reflected by a vocally modulated mirror. The sound could be recovered with an ordinary telephone receiver connected to a selenium cell illuminated by the light. Bell published the results in a presentation to the American Association for the Advancement of Science in 1880. The Photoacoustic Effect Benjamin T. Spike Physics 325 April 21, 2006 Schematic illustration of photoacoustic imaging ACS Nano 2010 4 (8), 4559-4564 In vivo flow cytometrie – detekce specifických signálů  Detekce fotoakustických a fototermálních jevů Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry - aplikace Shrnutí přednášky  „High-throughput“ průtoková cytometrie …  … a uplatnění vícebarevné detekce a beads array  sortrování chromozómů  aplikace v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých  in vivo průtoková cytometrie Na konci dnešní přednášky by jste měli: 1. vědět co je to „high-throughput„ průtoká cytometrie …a jak se v ní může uplatnit princip vícebarevného značení. 2. znát základní principy měření a sortrování chromozómů pomocí průtokového cytometru; 3. mít představu o možných aplikacích průtokové cytometrie v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých; 4. rozumět limitům a principům in vivo průtokové cytometrie. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie