1
Principy microarrays
Pavla Gajdušková
Analytická cytometrie, 15., 22. a 29. listopadu 2011
Microarrays
Kolekce DNA sond přichycených k pevnému podkladu
Fotolitografie„Tištěná“ microarrays
2
Microarray technologie
I. Výběr sond (probes): cDNA vektory, BAC vektory,
krátké nebo dlouhé oligonukleotidy, proteiny, tkáně
II. Příprava microarray: nanesení sond na sklo nebo
membránu
III. Design experimentu: zvolení správné metody, použití
referečního vzorku, záměna fluorescenčních barev
IV. Fluorescenční značení vzorků
V. Analýza microarray obrazů: nalezení sond v obraze,
korekce pozadí, výpočet intenzity v jednotlivých
bodech
IV. Analýza dat: filtrování, normalizace, porovnání
výsledků získaných z více microarray experimentů –
klastrovací analýza
Obsah přednášky
Technologie přípravy microarrays
Oblasti použití microarrays v biologii
Úvod do statistického hodnocení dat
Příklady konkrétních aplikací z literatury
3
Technologie přípravy microarrays
I. tisk pomocí skleněných kapilár (na podložní skla)
(výzkumné laboratoře)
III. fotolitografie (Affymetrix, NymbleGen)
II. ink-jet tisk (Agilent)
IV. samosestavování silikonových kuliček (Illumina)
Microarrays tištěná pomocí skleněných kapilár
4
Microarrays tištěná pomocí skleněných kapilár
Úprava povrchu sklíček pro tisk arrays I
povrchová úprava skla: amino modifikace, poly-L-lysine
modifikace povrchu → natisknutí DNA sond → UV ozáření
From Lee N. H. presentation: Introduction to High Density Microarrays
Sklo
5
Úprava povrchu sklíček pro tisk arrays II
DNASklo
From Lee N. H. presentation: Introduction to High Density Microarrays
povrchová úprava skla: epoxidová modifikace
úprava DNA: amino-modifikace DNA
Zdroj DNA pro tisk pomocí kapilár
I. dlouhé oligonukleotidy:
~ 60 - 70mers
komerčně dostupné (Operon, Agilent)
II. cDNA:
knihovny cDNA vektorů (IMAGE, MGC)
dostatečné množství DNA se vyprodukuje pomocí PCR
(univerzální primery pro daný typ vektorů)
III. BAC (Bacterial Artificial Clones): malý výtěžek při izolaci,
vysokomolekulární (lepivá) DNA, nutná následná
amplifikace DNA spojená s rozdělením na menší úseky
(DOP-PCR, ligation-mediated PCR)
6
“ink-jet” tisk
oligonukleotidy 60 bazí
pravidelnější tvar
a rozmístění bodů
firma: Agilent
Fotolitografický způsob přípravy
„In-situ“ syntéza
syntéza oligonukleotidů přímo na membráně
7
Fotolitografický způsob přípravy (Affymetrix)
sondy = oligonukleotidy délky 25 bazí
sondy = oligonucleotidy 45-85 bazí
podobná teplota tání (Tm)
Fotolitografický způsob přípravy (NimbleGen)
8
Samosestavování silikonových kuliček
základní stavební jednotka: silikonová kulička (3uM), která je pokryta
mnoha kopiemi stejných specifických oligonukleotidů
kulička nemá přesně dané místo na sklíčku, po fixaci na sklíčku je její
typ identifikován díky sekvenci části oligonukleotidu
Obsah přednášky
Technologie přípravy microarrays
Oblasti použití microarrays v biologii
Úvod do statistického hodnocení dat
Příklady konkrétních aplikací z literatury
9
exprese proteinů (ELISA)proteinprotilátkyProtein
všechno dříve zmíněné,
sekvenování, anotace genů
všechno dříve zmíněnéDNATilling
místa vazby transkripčních
faktorů, modifikace histonů
DNA (ChiP
obohacená)
DNA (promotorové
oblasti ~ 1kb)
Promoter
míra metylace promotorových
oblastí
DNA (ovlivněná
bisulfidem sodným)
DNA (CpG islands)Metylace
detekce „Single Nucleotid
Polymorphysms“; změny v
genomu
DNADNA
(oligonukleotidy)
SNP
změny v genomu (zisk, ztráta
chromozomů nebo jejich částí
DNADNA (BAC vektory,
oligonukleotidy)
CGH
měření množství miRNAmiRNAoligonukleotidymiRNA
měření množství mRNA v
bunkách, nádorech ...
cDNA / mRNADNA (cDNA,
oligonucleotidy)
Expresní
... analýza čeho
Co se
fluorescenčně
značí a hybridizuje
Sondy
na microarray
Typ array
Oblasti použití microarrays v biologii
Oblasti použití microarrays v biologii
DNA RNA protein
transkripce translace
10
Oblasti použití microarrays v biologii
DNA RNA protein
Schena M., Shalon D., Davis R. W., Brown P. O.
Quantitative monitoring of gene expression patterns with a
complementary DNA microarray. Science 270: 467-70, 1995.
transkripce translace
Genová exprese
Exon1 Exon2 Exon3 Exon4 Exon5 Exon6
mRNA
Intron1 Intron2 Intron3 Intron4 Intron5
DNA
5’ 3’
transkripce
translace
protein
ATG STOP
untranslated regions
11
Genová exprese
Exon1 Exon2 Exon3 Exon4 Exon5 Exon6
mRNA
Intron1 Intron2 Intron3 Intron4 Intron5
DNA
5’ 3’
transkripce
cDNA
zpětná
transkripce
(RT)
cDNA: jednořetězcová DNA (v dalším kroku je možné syntetizovat druhý řetězec)
u genů s dlouhou mRNA nemusí vznikat vždy celá cDNA
5’3’
Metody měření množství mRNA
From Lee N. H. presentation: Introduction to High Density Microarrays
•RT-PCR and Real-time RT-PCR
12
Měření množství mRNA
(microarrays tištěné pomocí skleněných kapilár)
I. dlouhé oligonukleotidy:
~ 60 - 70mers
komerčně dostupné (Operon, Agilent)
II. cDNA:
knihovny cDNA vektorů (IMAGE, MGC)
dostatečné množství DNA se vyprodukuje pomocí PCR
(univerzální primery pro daný typ vektorů)
5’ 3’
mRNA
dlouhé oligonukleotidy
c DNA
Typ sond
13
Experimentální design
Příklady použití v molekulární biologii (na úrovni mRNA):
• aplikace chemické látky na buněčnou kulturu a její vliv na expresi
různých genů (najít geny, které sníží nebo naopak zvýší expresi mRNA)
• zvýšení exprese mRNA zvoleného genu vnesením plasmidu →
nalezení dalších genů se změněnou expresí
• snížení exprese mRNA zvoleného genu po vnesení specifické siRNA →
nalezení dalších genů se změněnou expresí
Experimentální design
Porovnání exprese mezi vzorky:
Loop design: každé dva vzorky
jsou hybridizovány na jedno sklo
(plus vzájemná záměna
fluorochromů)
Reference design: každý vzorek
je hybridizován s referenčním
vzorkem, který pak slouží jako
převodník mezi různými vzorky
A E
C
AB
DB
ECA DB
R
???
E
CA
D
B
E
CA
D
B1.
2.
14
Loop design
poskytuje přímé srovnání mezi vzorky
o každém vzorku získáme více informací - kontrola
vyžaduje větší množství RNA z každého vzorku
špatný vzorek více ovlivní celý experiment
Reference design
lze jednoduše rozšířit o nový vzorek
jednodušší interpretace výsledků
vyžaduje méně RNA ze vzorků
špatný vzorek méně ovlivní celý experiment
Experimentální design
Fluoresceční značení
Značení:
Přímé: jeden z nukleotidů je značen fluorescenční značkou
nukleotid s fluorescenční barvou zaujímá více místa
značen každý 30-35 nukleotid nižší intenzita fluorescence
než nepřímé značení
Nepřímé: jeden z nukleotidů modifikován reaktivní amino
skupinou, na kterou se potom váže fluorochrom (NHS
ester forma)
pracnější v laboratoři než přímé značení
15
Měření množství mRNA
(fotolitograficky připravené microarrays)
Typ sond
oligonukleotidy 25 bazí
Perfect Match vs MisMatch oligonukleotidy
PM MM
cDNA
16
Dříve:
sondy blíže k 3’ konci mRNA
11-16 na jeden gen
PM, MM sondy
Typ sond
oligonukleotidy 25 bazí
Nyní:
sondy v různých exonech genu (ideálně 4 sondy v každém exonu)
jenom PM sondy
umožňuje studovat alternativní sestřih
Experimentální design
Příklady použití v molekulární biologii (na úrovni mRNA):
• aplikace chemické látky na buněčnou kulturu a její vliv na expresi
různých genů (najít geny, které sníží nebo naopak zvýší expresi mRNA)
• zvýšení exprese mRNA zvoleného genu vnesením plasmidu →
nalezení dalších genů se změněnou expresí
• snížení exprese mRNA zvoleného genu po vnesení specifické siRNA →
nalezení dalších genů se změněnou expresí
17
Nepřímé: jeden z nukleotidů modifikován biotinem, který se detekuje
pomocí fluorescenčně značené protilátky až po hybridizaci
biotinem se značí cRNA (in vitro transcription)
mRNA first strand cDNA double strand cDNA cRNA
Fluoresceční značení
Porovnání tištěných a fotolitograficky
připravených microarrays
nepřímé srovnáníumožňuje přímé srovnánídesign
experimentu
dříve nemožná,
dnes možná
jednoducháúprava podle
požadavků
možné studovatnelze studovat
(neplatí pro dlouhé oligo)
alternativní
sestřih
menší variabilita mezi
sklíčky
větší variabilita mezi
sklíčky
tisk
jednoduššínáročná
práce s knihovnami
(neplatí pro dlouhé oligo)
příprava
až 6 500 000až 33 000počet sond
fotolitografietisk kapilárami
18
Měření množství mRNA
(Allumina samosestavovací arrays)
Samosestavování silikonových kuliček
základní stavební jednotka: silikonová kulička (3uM)
kulička nemá přesně dané místo na sklíčku, po fixaci na sklíčku je její
typ identifikován díky sekvenci části oligonukleotidu
oligonukleotid:
I. adresa (definuje typ kuličky)
II. vlastní sonda - oligonucleotid (50 bp), který je specifický
pro jednotlivé transkripty
míra exprese mRNA = intenzita fluorescence navázané cRNA
19
Objevování nových transkriptů
objevování nových transkriptů, které nejsou ještě ve veřejných
databázích (např. SeqRef, Emsembl)
nebylo to možné pomocí výše zmíněných technologií, protože ty
jsou založené na znalostech obsažených v databázích
Řešení:
tilling arrays (Affymetrix)
mRNA sequencing (Illumina)
„Tilling“ arrays
sondy na sklíčku pokrývají kompletně určitou oblast
genomu popř. celý genom
repetitivní sekvence nejsou pokryty (před návrhem sond jsou
odstraněny pomocí programu „RepeatMasker“)
sondy: oligonukleotidy
např: 14 arrays, každé obsahuje 2x 3 250 000 sond
25 bazí sonda, PM a MM, mezera mezi sondami 10 bazí
po hybridizaci s fluorescenčně značenou cRNA „svítí“ sondy, které představují
transkribovaná místa ve studované oblasti (genomu)
sondy v místech „bez transkripce“ mají intenzitu fluorescence na úrovni pozadí
lze detekovat nové exony, jejich alternativní sestřih
20
mRNA sequencing
objevování nových transkriptů pomocí Illumina sekvenační technologie
není potřeba navrhovat, tisknout nebo syntetizovat sondy
mRNA first strand cDNA double-stranded cDNA fragmentace
sekvenace (Illumina technologie) ligace adapterů
mRNA sequencing
21
exprese proteinů (ELISA)proteinprotilátkyProtein
všechno dříve zmíněné,
sekvenování, anotace genů
všechno dříve zmíněnéDNATilling
místa vazby transkripčních
faktorů, modifikace histonů
DNA (ChiP
obohacená)
DNA (promotorové
oblasti ~ 1kb)
Promoter
míra metylace promotorových
oblastí
DNA (ovlivněná
bisulfidem sodným)
DNA (CpG islands)Metylace
detekce „Single Nucleotid
Polymorphysms“; změny v
genomu
DNADNA
(oligonukleotidy)
SNP
změny v genomu (zisk, ztráta
chromozomů nebo jejich částí
DNADNA (BAC vektory,
oligonukleotidy)
CGH
měření množství miRNAmiRNAoligonukleotidymiRNA
měření množství mRNA v
bunkách, nádorech ...
mRNA / cDNADNA (cDNA,
oligonucleotidy)
Expresní
... analýza čeho
Co se
fluorescenčně
značí a hybridizuje
Sondy
na microarray
Typ array
Oblasti použití microarrays v biologii
Použití microarrays ke studiu DNA
Komparativní genomická hybridizace
BAC arrays
oligo arrays
SNP arrays
tilling arrays (BAC a oligonukleotidy)
exon-specific arrays
(dříve i cDNA arrays používané pro expresi)
Genotypování
SNP arrays
Sekvenování
Re-Sequencing arrays
ChIP-Chip exprerimenty
tilling arrays (oligonukleotidy)
22
Komparativní genomická hybridizace (CGH)
molekulárně cytogenetická metoda, která slouží k analýze změn
obsahu DNA v živých organismech
(delece, zisk, amplifikace různých oblastí genomu)
porovnávání intenzity fluorescence zkoumaného vzorku DNA a
normálního diploidního vzorku DNA v různých místech
genomu
Komparativní genomická hybridizace (CGH)
Mantripragada et al. Trends in Genetics 2003
23
metafázní chromozomy
- dárce s normálním
diploidním karyotypem
DNA:
cy3
zkoumaný vzorek
cy5
referenční DNA – 2n
From Szuhai K. presentation: Determination of Genomic Imbalances by
Genome-wide Screening Approaches
Komparativní genomická hybridizace (CGH)
rozlišení ~ 20MB
From Szuhai K. presentation: Determination of Genomic Imbalances by
Genome-wide Screening Approaches
Komparativní genomická hybridizace (CGH)
24
From Szuhai K. presentation: Determination of Genomic Imbalances by
Genome-wide Screening Approaches
Komparativní genomická hybridizace (CGH)
„Array“ komparativní genomická hybridizace
(Array CGH)
chromozomy nahrazeny body na mikroskopickém sklíčku,
které obsahují specifické DNA sekvence
25
Typy sond natištěných na microarray sklíčku
BAC klony až 32 000 BAC klonů na jednom sklíčku
~ 160 kb dlouhé úseky DNA
Oligonukleotidy 25 – 80 bazí dlouhé oligonukleotidy
mohou pokrývat i celý genom (repetitivní
sekvence jsou vynechány)
známe polohu a pořadí všech sond v lidském genomu
Knihovny BAC klonů pro array CGH
BACPAC resources (CHORI)
Research Genetics (Invitrogen)
The Sanger Centre
http://www.geneservice.co.uk/home/
Cheung V. G. et al., Integration of cytogenetic landmarks into the draft
sequence of the human genome. Nature 409: 953 – 958, 2001.
Krzywinski M. et al., A set of BAC clones spanning the human genome.
Nucleic Acids Res 32: 3651-3660, 2004.
Greshock J. et al., 1-Mb Resolution Array-Based Comparative Genomic
Hybridization Using a BAC Clone Set Optimized for Cancer Gene Analysis.
Genome Res 14: 179-187, 2004.
http://www.resgen.com/resources/index.php3
http://bacpac.chori.org
26
Array CGH s použitím BAC klonů
Log2Rat = Log2 R/G
Log2Rat = 0 2 kopie
Log2Rat = 0.5 3 kopie (“gain”)
Log2Rat = 1 4 kopie (“gain”)
Log2Rat = 2 8 kopií (“amplification”)
2464 BAC klonů UCSF HumArray3.1
Log2Rat = -1 1 kopie (“loss”)
Log2Rat < -1 homozygotní delece
Typy sond natištěných na microarray sklíčku
BAC klony až 32 000 BAC klonů na jednom sklíčku
~ 160 kb dlouhé úseky DNA
Oligonukleotidy 25 – 80 bazí dlouhé oligonukleotidy
mohou pokrývat i celý genom (repetitivní
sekvence jsou vynechány)
známe polohu a pořadí všech sond v lidském genomu
27
Array CGH - oligonukleotidy (NimbleGen)
Selzer RR et al. Genes Chromosomes Cancer, 2005
6-kb median
probe spacing
50- or 140-bp median
probe spacing
SNPs
SNP = single nucleotide polymorphism
jednonukleotidové variace, které jsou náhodně rozmístěny v
genomu (bodové mutace rozšířené v populaci)
nukleotidová variace, která se vyskytuje alespoň u 1% jedinců v
populaci
předpokládaný počet SNPs: 10 milionů
výskyt specifických SNP spojen s predispozicí k určitým chorobám
28
SNP Arrays – probe design (Affymetrix)
From Xiao Y. presentation: Exploration and Analysis of Affymetrix SNP Arrays. Center for
Bioinformatics & Molecular Biostatistics, UCSF Division of Biostatistics
SNP Arrays – probe design
From Xiao Y. presentation: Exploration and Analysis of Affymetrix SNP Arrays. Center for
Bioinformatics & Molecular Biostatistics, UCSF Division of Biostatistics
29
SNP arrays x expression arrays
From Xiao Y. presentation: Exploration and Analysis of Affymetrix SNP Arrays. Center for
Bioinformatics & Molecular Biostatistics, UCSF Division of Biostatistics
SNP Arrays - labeling
From Xiao Y. presentation: Exploration and Analysis of Affymetrix SNP Arrays. Center for
Bioinformatics & Molecular Biostatistics, UCSF Division of Biostatistics
30
SNP Arrays - APEX technologie
APEX = Arrayed Primer Extension
Kurg A. et al., Arrayed primer extension: solid-phase four-color DNA
resequencing and mutation detection technology. Genet Test 4:1-7, 2000.
Velké studie SNP
HapMap projekt: mezinárodní projekt, jehož cílem je identifikovat a
katalogizovat SNPs v lidské populaci a vybrat z nich „tag“ SNPs,
kterými se skupiny lidí odlišují
SNPs, které jsou na DNA
blízko sebe se také
společně dědí a určují
haplotyp dané skupiny lidí
„tag“ SNPs odlišují dané haplotypy
31
HapMap kolekce lidské DNA 270 vzorků DNA
populace: Nigerie 30 trojic vzorků (matka, otec, dítě)
Japonsko 45 nepříbuzných vzorků
Čína 45 nepříbuzných vzorků
USA 30 trojic vzorků (matka, otec, dítě)
HapMap projekt
http://www.hapmap.org/index.html.en
The International HapMap Consortium. A second generation human haplotype map
of over 3.1 million SNPs. Nature 449, 851-861. 2007.
The International HapMap Consortium. A Haplotype Map of the Human Genome.
Nature 437, 1299-1320. 2005.
Velké studie SNP
Wellcome Trust Case control Consortium. Genome-wide association study of 14,000
cases of seven common diseases and 3,000 shared controls. Nature. 2007 Jun
7;447(7145):661-78.
3000 zdravých jedinců
2000 pacientů bipolar disorder (1 SNP)
„ coronary artery disease (1 SNP)
„ Crohn’s disease (9 SNPs)
„ hypertension
„ rheumatoid arthritis (3 SNPs)
„ type 1 diabetes (1 SNP)
„ type 2 diabetes (3 SNPs)
Studovali 500 000 SNPs pomocí Affymetrix microarrays
P value < 5x10-7
32
Odchylky od referenčního genomu větší než 1kb
ještě v roce 2003 se myslelo, že většina „zdravých“ lidí se od
referenčního genomu liší velmi nepatrně (SNPs, mikrosatelity)
array komparativní genomická hybridizace odhalila mnoho větších
oblastí DNA, které se u zdravých lidí vyskytují v různém počtu
DNA segment (většinou větší než 1 kb), který se u daného jedince
vyskytuje v jiném počtu kopií než v referenčním lidském genomu
existuje mnoho takových oblastí v genomu (řádově tisíce)
“Database of Genomic Variants”
http://projects.tcag.ca/variation/
Copy number polymorphism – výskyt u více než 1% jedinců dané populace
Využití HapMap kolekce ke studiu copy number variant
všichni jedinci v této kolekci byli zdraví, přesto se našlo velké množství oblastí
DNA (12% genomu), které se u těchto lidí nacházejí v různém počtu kopií
Copy number variation
33
hledání fenotypových projevů CNV („neškodná“ genomová
varianta nebo příčina nemoci???)
CNV: pathogenic x benign x unknown clinical significance
vnášejí „zmatek“ do experimenů, které např. hledají příčinu
vrozených genetických poruch (mentální opožděnost, vývojové
odchylky)
Copy number variation
Chromatin ImmunoPrecipitation on chip
ChIP-Chip
34
Nalezení vazebného místa
256 kb oblast 1p32 pokrytá překrývajícími se PCR produkty (~400 bp)
protilátka: trimethylace histonu H3 Lys4
Carter and Vetrie 2004 Human Mol Genet
Obsah přednášky
Technologie přípravy microarrays
Oblasti použití microarrays v biologii
Úvod do statistického hodnocení dat
Příklady konkrétních aplikací z literatury
35
Úvod do statistického hodnocení dat
Předpříprava dat pro statistické hodnocení
analýza obrazu (měření intenzity bodů a pozadí)
normalizace (nalezení a odstranění systematických chyb, které
nejsou způsobeny biologickým objektem)
filtrování dat (odstranění špatných bodů nebo hybridizací ze studie)
Nalezení rozdílně exprimovaných genů
výpočet zvolené statistiky a následné určení p hodnot
úprava p-hodnot
Analýza obrazu
Red Green Dapi
16-bitový obraz ve stupních šedi
hodnoty intenzity: 0 - 65 536
36
Analýza obrazu
rozdělení pixelů v nasnímaném
obraze na ty, které nesou informaci o
intenzitě bodů na sklíčku nebo
pozadí
Subarray
mnoho programů na analýzu
microarray obrazů (GenePix, Spot, ...)
výsledek: txt soubor – každý řádek
obsahuje informaci o jednom bodu na
sklíčku (průměrná intenzita uvnitř
bodu, intenzita okolí, variabilita mezi
pixely uvnitř bodu, ...)
Analýza obrazu
Nejdůležitější hodnota: poměr mezi intenzitami fluorescence R a G
R/G
Nejčastěji se vyjadřuje pomocí logaritmu o základu 2
M = Log2 R/G
Log2 R/G = 1
Log2 R/G =-1
ve vzorku značeném červeně je dvakrát více kopií
specifické mRNA než v zeleně značeném vzorku
ve vzorku značeném červeně je poloviční množství
kopií specifické mRNA než v zeleně značeném
vzorku
37
Důležité předpoklady
Sondy na sklíčku jsou rozmístěny zcela náhodně
do stejné pozice na sklíčku neseskupujeme geny s podobnou funkcí;
sekvenčně příbuzné; ležící na stejném chromosomu
Hybridizace byly prováděny v náhodném pořadí
kontroly byly hybridizovány dohromady se zkoumanými vzorky
Předpokládáme, že experiment ovlivní expresi pouze malého
počtu genů v daném objektu (většina genů svoji expresi nemění)
průměr (medián) všech poměrů R/G je roven 1
průměr (medián) všech logaritmů poměrů R/G je roven 0
nestačí mít na sklíčku sondy pro geny, které nás zajímají nebo očekáváme, že
jejich exprese se bude měnit
pro normalizaci jsou nutné i další geny, jejichž exprese se nemění (těch by
měla být většina)
Analýza obrazu
M = Log2 R/G
0 1 2
M=log2R/G
-4
-2
0
2
4
6
A = log2 (R/G)/2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
M=log2R/G
-4
-2
0
2
4
Další důležitá hodnota pro kontrolu kvality hybridizace je
průměrná intenzita bodu v obou snímaných kanálech
A = (Log2R + Log2G) / 2
A = (Log2R + Log2G) / 2
38
Odstranění „špatných“ bodů
odstranění bodů: body s morfologickými abnormalitami
(problematický tisk)
s nízkou intenzitou (není exprese v
daném systemu)
s vysokým pozadím (negativní hybridizace)
Kontrolní body: prázdné body bez DNA (negativní kontrola)
„spiked“ body (pozitivní kontrola)
stejné sondy na různých místech sklíčka
Normalizace
nalezení a odstranění systematických chyb, které nejsou
způsobeny biologickým objektem
39
A = log2 (R/G)/2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
M=log2R/G
-4
-2
0
2
4
A = log2 (R/G)/2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
M=log2R/G
-4
-2
0
2
4
Normalizace
Není splněná podmínka, že průměr (medián)
všech logaritmů poměrů R/G je roven 0
Před normalizací: Po normalizaci:
Loess Normalizace
40
16151413
1211109
8765
4321
“Print Tip” Normalizace
Před normalizací:
Po normalizaci:
Normalizace mezi arrays
Všechny hybridizace v dané studii by měly mít podobné
rozložení hodnot kolem mediánu
“Median Absolute Deviation (MAD) Scaling“
41
Product Authors/Company/Institute
Interface/Operating
System
Reference/Features
ArrayStat 1.0 Imaging Research Inc. Windows
Software package optimised for statistical analysis of
array gene expression data. Quality control, statistical
tests of differential expression
Bioconductor
The R Project for Statistical
Computing
R-package An open source and open development software project
for the analysis and comprehension of genomic data
BRB ArrayTools
3.2.3
Molecular Statistics and
Bioinformatics Section,
Biometric Research Branch,
NCI
Excel add-in, R-
package
Wright GW et al. A random variance model for detection
of differential gene expression in samll microarray
experiments. Bioinformatics 2003 19:2448-2455.
dCHIP
Wong Lab, Harvard School
of Public Health and DanaFarber
Cancer Institute
Windows
Li C and Wong WH (2001) Model-based analysis of
oligonucleotide arrays: Expression index computation
and outlier detection, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 98, 31-
36
Genetraffic 3.1 Iobion Informatics
Linux server,
web client
Analysing and visualizing microarray expression data.
Compliant with MIAME & MAML standard.
Lucidea Array
Spotfinder 1.0
Amersham Biosciences Windows
Fully automated image analysis software, taking into
account pen effects and calculating various quality
metrics
Lucidea Microarray
Scorecard 1.0
Amersham Biosciences Windows
Software package developed to analyse data from twocolor
experiments, calculate various quality metrics and
normalize data using an exponential method
R-package
The R Project for Statistical
Computing
R-package
One most famous statistical packages. Most libraries
including specific ones for the analysis of microarray
data.
SpotFire.net
Desktop 5.0
SpotFire Windows Asher B. Decision analytics software solutions for
proteomics analysis. J Mol Graph Model 2000 18: 79-82.
TIGR Microarray
Data Analysis
Software (MIDAS)
The Institute for Genomic
Research (TIGR)
Java tested on
Windows
2000/XP, Linux
7.2, MacOS
10.2
Saeed AI et al. TM4 : a free, open-source system for
microarray data management and analysis.
Biotechniques 2003 34:274-278
XLstat 3D Plot Addinsoft Excel add-in
Xlstat 3D Plot is a complement module for Xlstat Pro that
allows to display data in 3 dimension with an intuitive
interface.
XLstat Pro 7.1 Addinsoft Excel add-in Sotware package for statistical analysis including a wide
range of functionalities
Programy pro předpřípravu dat
http://arraysimage. free.fr/Soft.htm
Nalezení rozdílně exprimovaných genů
Array 1 Array 2 Array 3 Array 4
Gen 111
Gen 112
Gen 113
Gen 114
Gen 115 0.450.540.490.88
0.38-0.130.13-0.19
0.440.280.14
0.640.370.33-0.28
0.06-0.390.39
:
:
odstranění špatných bodů, provedena vhodná normalizace intenzit
Nulová hypotéza: medián exprese daného genu se statisticky
neliší od teoretické hodnoty mediánu (v našem případě 0)
Pro každý gen testujeme tuto hypotézu zvlášť
0.52
0.00
0.28
0.35
0.06
Medián
42
Array 1 Array 2 Array 3 Array 4
Gen 111
Gen 112
Gen 113
Gen 114
Gen 115 0.450.540.490.88
0.38-0.130.13-0.19
0.440.280.14
0.640.370.33-0.28
0.06-0.390.39
:
:
Nalezení rozdílně exprimovaných genů
0.99
p hodnota
0.02
0.38
0.25
0.78
Nulová hypotéza: medián exprese daného genu se statisticky
neliší od teoretické hodnoty mediánu (v našem případě 0)
T = ...... p hodnota riziko s jakou lze nulovou
hypotézu odmítnout
rozdílně exprimované geny … p hodnota < 0.01 (volitelný práh)
Statistické problémy při studiu tisíců genů
s malým počtem opakování experimentů
rozdílně exprimované geny … p hodnota < 0.01
Příklad:
studujeme 20 000 genů na jednom sklíčku
během normalizace a kontroly kvality vyřadíme 12000 genů
testujeme 8 000 genů (pro každý vypočítáme p hodnotu)
p hodnota < 0.01 připouštíme, že 1% testovaných genů je označeno
jako rozdílně exprimované pouze náhodnou
variabilitou pokusů
8000 * 0.01 = 80 genů
korekce p hodnot s ohledem k počtu testovaných genů
použití alternativních statistik
43
From Ru-Fang Yeh presentation: Statistical Methods in Bioinformatics: Case Studies.
Center for Bioinformatics & Molecular Biostatistics, UCSF Division of Biostatistics
From Ru-Fang Yeh presentation: Statistical Methods in Bioinformatics: Case Studies.
Center for Bioinformatics & Molecular Biostatistics, UCSF Division of Biostatistics
44
Obsah přednášky
Technologie přípravy microarrays
Oblasti použití microarrays v biologii
Úvod do statistického hodnocení dat
Příklady konkrétních aplikací z literatury
Klastrování (shluková analýza) je obecná metoda, kterou je
možno použít ke spojování prvků (s podobnými vlastnostmi)
do skupin (klastrů)
Microarray analýza:
Klastrování genů (řádků) identifikace skupin genů, které mohou
být společně regulované
Klastrování vzorků (sloupců) nalezení skupin vzorků, které mají
podobné změny v expresi genů (změny na
úrovni DNA)
Klastrování
Příklad:
Sorlie et al., Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish
tumor subclasses with clinical implications. PNAS 98: 10869-10874, 2001.
45
78 karcinomů prsu (71 duktálních, 5 lobulárních a 2 in-situ)
3 fibroadenomy
4 vzorky normální tkáně prsu
Microarrays: 8 102 cDNA klonů
každý vzorek (Cy3) hybridizován s referenční RNA (Cy5)
Analýza: nalezeno 456 cDNA klonů (427 genů) s velkou
variabilitou exprese mezi různými vzorky, ale podobnou
expresí u příbuzných vzorků
Otázka: Zda existuje rozdělení karcinomů do podskupin, které
mají podobné změny v expresi genů?
Sorlie et al., PNAS 98: 10869-10874, 2001.
Design experimentu
Sorlie et al., PNAS 98: 10869-10874, 2001.
Klastrování
46
Sorlie et al., PNAS 98: 10869-10874, 2001.
Sorlie et al., PNAS 98: 10869-10874, 2001.
Rozdělení do skupin a
prognóza vývoje onemocnění
47
Programy pro analýzu microarray dat
http://arraysimage. free.fr/Soft.htm
Product Authors/Company/Institute
Interface/Operating
System
Reference/Features
ArrayStat 1.0 Imaging Research Inc.
Windows
NT/2000
Software package that is optimised for statistical analysis
of array gene expression data. Quality control, statistical
tests of differential expression
BRB ArrayTools
3.2.3
Molecular Statistics and
Bioinformatics Section,
Biometric Research Branch,
NCI
Excel add-in, R-
package
Wright GW et al. A random variance model for detection
of differential gene expression in samll microarray
experiments. Bioinformatics 2003 19:2448-2455.
Cluster
Michael Eisen's
lab;Lawrence Berkeley
National Lab (LBNL)
Windows
95/98/NT
Eisen MB et al. Cluster analysis and display of genomewide
expression patterns. Proc Natl Acad Sci USA 1998
95:14863-14868.
Cluster
Indentification Tool
(CIT)
Van Andel Research
Institute
Windows
Rhodes DR et al. CIT: identification of differentially
expressed clusters of genes from microarray data.
Bioinformatics 2002 18:205-206.
FDR controlling
procedure
(FDRalgo)
Windows
Adjusts p-values generated in multiple hypothesis testing
of gene expression data obtained by cDNA microarray
experiment.
Genesis
Bioinformatics Group,
Institute of Biomedical
Engineering, Graz
University of Technology
Java, tested on
Windows
Java suite containing various tools such as filters,
normalization, visualization tools, clustering, SOM, kmeans,
PCA, SVM, map onto chromosomal sequences.
Genetraffic 3.1 Iobion Informatics
Linux server,
web client
Analysing and visualizing microarray expression data.
Compliant with MIAME & MAML standard.
J-express
Bioinformatics research
group at the Dept. of
Informatics
Java, tested on
Windows 2000,
LINUX, Thru64
UNIX, Solaris
and Irix
Analysing gene expression data giving access to
hierarchical clustering, k-means, SOM, PCA, MDS,
profile similarity search and visualizing methods.
LACK Windows Kim C et al. Significance analysis of lexical bias in
microarray data. Bioinformatics 2003, 4:12.
Prediction Analysis
for Microarray
(PAM)
Tibshirani Lab,
Departement of Statistics,
Stanford University
Excel add-in/ R-
package
Narasimhan and Chu. Diagnosis of multiple cancer types
by shrunken centroids of gene expression; PNAS 2002
99:6567-6572.
R-package
The R Project for Statistical
Computing
R-package
One most famous statistical packages. Most libraries
including specific ones for the analysis of microarray
data.
Significance
Analysis of
Microarrays (SAM)
Tibshirani Lab,
Departement of Statistics,
Stanford University
Excel add-in/ R-
package
Tibshirani and Chu. Significance analysis of microarrays
applied to the ionizing radiation response. PNAS 2001
98: 5116-5121
SpotFire.net
Desktop 5.0
SpotFire Windows Asher B. Decision analytics software solutions for
proteomics analysis. J Mol Graph Model 2000 18: 79-82.
Veřejné databáze microarray dat
ArrayExpress
ChipDB
ExpressDB
Gene Expression Atlas
Gene Expression Database (GXD)
Gene Expression Omnibus (GEO)
GeneX
GermOnline
Human Gene Expression Index (HuGE Index)
List Of Lists Annotated (LOLA)
M-CHiPS (Multi-Conditional Hybridization Intensity Processing System)
MUSC DNA Microarray Database
NASCArrays
Oncomine
Public Expression Profiling Resource (PEPR)
READ (RIKEN cDNA Expression Array Database)
Rice Expression Database (RED)
RNA Abundance Database (RAD)
Saccharomyces Genome Database (SGD): Expression Connection
SGMD
Standford Microarray Database (SMD)
Yale Microarray Database
yeast Microarray Global Viewer (yMGV)