Intracelulární detekce cytokinů.
Markéta Rodová
Analytická cytometrie 2011
cytokine
¢http://www.biosite.se/ViewGlossary.aspx?id=93

Cytokiny
¢molekuly zapojené do procesu buněčné signalizace
¢základní regulátory IS
¢klíčová role v apoptóze, angiogenezi, diferenciaci, růstu buněk
¢podílí se na morfogenezi a udržování homeostázy celého organismu
¢působí prostřednictvím receptorů cílových buněk
¢
¢pleiotropní účinky
¢působí v kaskádě
¢cytokinový systém – redundantní
¢
¢působení
lautokrinní
lparakrinní
lendokrinní
l
¢proteiny, glykoproteiny, peptidy
l
¢
cytokines_definition il2
¢http://www.beltina.org/health-dictionary/cytokines-definition.html

Proč analyzovat intracelulární produkci cytokinů ?
¢Charakterizace různých subpopulací leukocytů, které lze rozlišit na základě rozdílné produkce
cytokinů.
¢Určení stupně aktivace/suprese lymfocytů.
¢Charakterizace funkčních vlastností buněk.
¢Identifikace klíčových faktorů onemocnění.
¢Identifikace molekulárních mechanismů účinků léčiv + vývoj nových.
¢Lze sledovat experimentálně ovlivněnou odpověď konkrétní populace na stimulaci.
¢…
cytokines_table_pmbcii t_cell_intracellular_cytokines
¢http://www.pmbcii.psy.cmu.edu

Jak detekovat intracelulární cytokiny
¢
¢Inhibice exportu proteinů z buňky (akumulace ve vezikulárním aparátu)
¢Fixace         permeabilizace         průnik protilátek do kompartmentů
¢
¢Immunobiology, Janeway, 2004
¢TAKE-HOME MESSAGE
¢ Problém – buňky uvolňují cytokiny do okolí = ztrácíme informaci o tom, která buňka daný cytokin
produkuje.
¢

Cytokine assays
¢ELISAs
¢Radioimmunoassays
¢+  citlivé, kvantitativní metody
¢-   pouze průměrné množství cytokinů
¢-   neposkytují „single-cell level“ analýzy
¢Flow cytometry
¢+  determinace antigenně specifických buněk produkujících cytokiny
¢+   poskytuje „single-cell level“ analýzy, fenotypizace
¢+   analýza aktivačních markerů, přítomnosti jednotlivých receptorů, dalších antigenů
¢+ vícebarevná analýza
¢(-)  limitace – množství detekovatelných fluorescenčních parametrů
ELISA
¢http://www.virology-online.com
Aria
¢http://www.biotech.iastate.edu

Princip
¢Stimulace
¢Aktivace
¢Značení povrchových molekul (fenotypizace)
¢Fixace
¢Lyzace
¢Permeabilizace
¢Značení intracelulárních cytokinů
¢Analýza průtokovým cytometrem

Jaké buňky lze analyzovat…?
¢PBMC (peripheral blood mononuclear cells)
¢whole blood
¢BAL (bronchoalveolar lavage cells)
¢mouse splenocytes
¢lymph node cells
¢thymocytes, etc.
¢
Dept11Lungs LymphNode_NevusCells1

Kvalita buněk
¢
lleukocyty treatované imunosupresivy jsou velmi citlivé na lyzační reagencie
lmohou mít pozměněnou morfologii, na pohled vypadají poškozeně
lpercentage of cytokine-positive cells - low
lbackground staining – high
l
lFSC/SSC – increase of debris area
l
lzmírnění – zkrácení doby
l lyzace a permeabilizace buněk
l
mb1413-fig-0002-1-full
¢http://www.currentprotocols.com/protocol/mb1413

PROTOKOL
¢Stimulace
lIonomycin (Streptomyces conglobatus)
lPMA (phorbol myristate acetate)
l-> zvýšení produkce cytokinů
¢Aktivace
lmonensin (Streptomyces cinnamonensis)
lbrefeldin A
lzabraňuje vyplavení cytokinů z Golgiho komplexu
l
ionomycin
¢IONOMYCIN
514px-Monensin_A
¢MONENSIN
¢http://en.wikipedia.org/wiki/File:Monensin_A.svg

PROTOKOL
¢Fenotypizace
lznačení povrchových antigenů
lvždy před fixací – zabránění destrukce antigenů fixačním médiem
¢Fixace
lfixační pufr
lobsahuje paraformaldehyd (1 nebo 4%)
lpřed permeabilizací - důležité pro zabránění
l ztráty cytokinů
ldoba fixace – důležitý parametr
•pokud jsou buňky „přefixované“, cytokiny
• nemusí reagovat s protilátkami
l

PROTOKOL
¢Lyzace erytrocytů
lRBC Lysis Buffer
l
¢Permeabilizace
lpermeabilizační pufr
l
¢Fixace a permeabilizace v jednom kroku
lBD Cytofix/Cytoperm™
l
lNOTE 2: Because saponin-mediated cell permeabilization is a reversible process, it is important to
keep the cells in the presence of saponin during intracellular cytokine staining.
¢http://parts.mit.edu/igem07/index.php/BerkiGEM2007Present1
D:\Markéta Rodová\muni\FCM\biolegend.gif D:\Markéta Rodová\muni\FCM\bd.JPG

Kity pro stanovení IC
¢Human: IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IFN, TNF, GM-CSF, GRO,
IP-10, MCP-1, MCP-3, MIG, MIP-1, RANTES
¢Mouse: IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, IFN, TNF, GM-CSF, MCP-1
¢Rat: IL-4, IL-10, GM-CSF
D:\Markéta Rodová\muni\FCM\2133.gif D:\Markéta Rodová\muni\FCM\biolegend.gif D:\Markéta
Rodová\muni\FCM\ebioscience.jpg D:\Markéta Rodová\muni\FCM\Biozol.jpg D:\Markéta
Rodová\muni\FCM\bd.JPG D:\Markéta Rodová\muni\FCM\molprobes_logo.gif

Fluorochromy
Kompenzace fluorescence
¢Alexa Fluor 488
¢Alexa Fluor 647
¢FITC
¢PE
¢PerCP
¢Cy5
¢PE-Cy5
¢PE-Cy5.5
spectraview
¢http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer/index.jsp
¢Excitační a emisní spektra FITC a PE
stokes shift
¢Introduction to Flow Cytometry, Rahman, 2006)
¢
¢Překryv spekter (spectral overlap)

Izotypová kontrola
¢odhalení nespecifických vazeb
l
¢http://www.rndsystems.com/cb_detail_objectname_SP99_TN_IntCytokineStaining.aspx
izo_1 izo_2
¢Yellow - isotype control alone
¢Blue - non-permeabilized cells
¢Red - permeabilized cells
¢
¢Cells stained for intracellular IL-1 beta.
¢Blue  - surface-blocked, non-permeabilized cells
¢Red – surface blocked, permeabilized cells
¢Human IL-1 beta/IL-1F2 Fluorescein MAb (Clone 8516), Mouse IgG1

MEASUREMENT OF INTRACELLULAR INTERFERON GAMMA AND INTERLEUKIN 4 IN T LYMPHOCYTES
IFNgamma_IL4
¢Histograms
¢IL-4-stained cells (A)
¢IFN-γ-stained cells (B)
¢Dot plots
¢population of cells producing IFN-γ and almost no IL-4 (C)
¢population of cells producing mostly IL-4 and little IFN-γ (D)
¢Current Protocols in Cytometry (2004)
¢APLIKACE FC

TGFβ1 inhibuje diferenciaci Th2 inhibicí exprese GATA-3.
¢ Leonid Gorelik, Patrick E. Fields, Richard A. Flavell. The Journal of Immunology, 2000, 165:
4773–4777.
¢C – ELISA
¢D - FACS
¢ GATA-3 podporuje sekreci IL-4 a IL-5 v Th2
¢ TGFβ1 inhibuje množství buněk diferencovaných do Th2 fenotypu
¢APLIKACE FC
¢CD4+ T cells (transgenic mice)

Literatura
¢Babcock GF - Intracellular Cytokines. Current Protocols in Cytometry (2004) 9.9.1-9.9.11. John
Wiley & Sons, Inc.
¢Gorelik L, Fields PE, Flavell RA. 2000. Cutting Edge: TGF-b Inhibits Th Type 2 Development Through
Inhibition of GATA-3 Expression. The Journal of Immunology. 165: 4773–4777.
¢Hořejší V, Bartůňková J. 2005. Základy imunologie. Triton, Praha
¢Janeway CH et al. Immunobiology. 2004. Garland Publishing, New York.
¢Rahman, M. 2006. Introduction to flow cytometry. Published by Serotec Ltd.
¢Roederer M, Murphy RF (1986). Cell-by-cell autofluorescence correction for low signal-to-noise
systems: application to EGF endocytosis by 3T3 fibroblasts. Cytometry 7:558-565.
¢Rodríguez-Caballero A, García-Montero A, Bueno C, Orfao A -  Flow Cytometric Analysis of Cytokine
Responses in Stimulated Whole Blood: Simultaneous Quantitation of TNF-α-Secreting Cells and Soluble
Cytokines.
¢Current Protocols in Cytometry (2003) 9.21.1-9.21.21. John Wiley & Sons, Inc.
¢Schuerwegh AJ, De Clerck LS, Bridts CH, Stevens WJ. 2003.Comparison of Intracellular Cytokine
Production With
¢Extracellular Cytokine Levels Using Two Flow Cytometric Techniques.  Cytometry Part B (Clinical
Cytometry) 55B:52–58
¢Flow cytometry educational guide
(http://www.upci.upmc.edu/cf/pdf/DAKO_flow_cytometry_educational_guide.pdf)
¢
¢
¢
¢http://www.bd.com
¢http://www.biolegend.com
¢http://www.ebioscience.com
¢
¢Obrázky
¢
¢http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11448
¢http://www.rndsystems.com/cb_detail_objectname_SP99_TN_IntCytokineStaining.aspx
¢http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer/index.jsp
¢http://parts.mit.edu/igem07/index.php/BerkiGEM2007Present1
¢http://www.currentprotocols.com/protocol/mb1413
¢http://www.virology-online.com
¢http://www.biotech.iastate.edu
¢http://www.pmbcii.psy.cmu.edu
¢http://www.bdbiosciences.com/research/tcell/tools/intrace_cyto.jsp
¢http://www.beltina.org/health-dictionary/cytokines-definition.html
¢http://www.genscript.com/protein/Z00368-Interleukin_2_IL_2_human.html
¢
¢
¢
¢
¢