1 Miniaturizace v analytické chemii Předpoklady pro miniaturizaci • „micromachining, microfabrication“ (litografie, reactive plasma etching ...) - výroba „čipů“ („microfabricated devices“) • kapiláry, mikrokanálky, mikrovialky - průměry 100 – 102 mm • lasery - možnost zaostřit na plošku o průměru ~ mm - kompatibilita s mikrokanálky a kapilárami • piezoelektrické mikropipetory, mikroelektrody, mikroreaktory, mikročástice atd. Výhody miniaturizace • menší objemy vzorků • rychlejší analýza (redukce délky transportu, optimizovaný transport hmoty pro chem. reakce a separace) – vysoký výkon, snížená cena na analýzu jednoho vzorku • redukce spotřeby činidel - redukce odpadu, vyšší reakční výtěžek – redukce reakčního času + příprava vzorku • možnost integrace a spojování “Lab-on-chip”, miniaturizované systémy totální analýzy („m-TAS“) • paralelní analýzy opakující se motiv na jednom čipu, vysoký výkon • snadná přenositelnost • masová výroba = nízká cena • mikroanalyzátory na jedno použití Základní typy čipů 1. 2D pole - afinitní pole: nejprve zakoncentrování specifických látek, poté MALDI MS přímo z čipu - pole vialek se špičkami pro ESI: zvýšení reprodukovatelnosti analýzy 2. Fluidní systém (čipy s kanálky) - systémy pro paralelní analýzu– pro ESI, MALDI ... - systémy integrující několik kroků (“Lab-on-chip”) dávkování, úprava vzorku, reakce, separace, detekce ... Spojení mikro + makro? např. čip a hmotnostní spektrometr Trendy TAS (total analysis system) ... systémy, kde vzorkování, úpravy vzorku, reakce, separace, detekce aj. jsou integrovány do jednoho přístroje, nejlépe miniaturizovaného - mTAS Využití TAS - env. chemie: kontrola znečištění a zdrojů kontaminace - farmaceutický a agrochemický výzkum resp. biomedicinální - screening - umělá čidla, např. umělý nos Rozměr nebo objem? Mikro – nano – piko? 100 mm x 100 mm x 100 mm = 10-12 m2 = 10-9 l = 10 nl 10 mm x 10 mm x 10 mm = 10-15 m2 = 10-12 l = 10 pl Nevýhody miniaturizace • změny poměrů délky, plochy a objemu vedou ke změnám vlivu fyzikálních parametrů na signál např. kapilární efekty – TRIBO polarograf • zvýšený poměr plocha/objem – sorpce, kontaminace • kratší doba analýzy • zvýšený transport tepla a hmoty (uvedené parametry mohou být výhody i nevýhody) 2 Technologie výroby čipů D. Mijatovic, J. C. T. Eijkel and A. van den Berg „Technologies for nanofluidic systems: top-down vs. bottom-up – a review“ Lab Chip, 2005, 5, 492–500 Procesy při výrobě čipů • vytvoření vzoru (litografie – hn, e-, ionty ...) • mechanické obrábění • leptání • odlévání (silikonová guma, polyakrylát) • tavení I.M.Lazar,J.Grym,F.Foret„Microfabricated Devices:ANewSampleIntroduction ApproachToMassSpectrometry“Mass SpectromRev.2006,25,573–594 GC na čipu deMello,LabChip,2002,2,48N–54N LC LC na čipu 3 LC na čipu deMello,LabChip,2002,2,48N–54N Mikrofluidika ... kanálky deMello,LabChip,2002,2,48N–54N LC: stacionární fáze deMello,LabChip,2002,2,48N–54N GE na čipu Protein sizing on a microfabricated device. A: Schematic of an 11 multisample microfabricated device that performs protein sizing by integrating on the chip the following steps: noncovalent fluorescent labeling of SDS-denatured proteins, separation, virtual destaining by dilution of the SDS below critical micelle concentration before detection, and detection; wells A4 and C4 are for the separation buffer and waste; B4 and D3 are used as load wells; D4 is the SDS dilution well; all other wells contain sample; (B) Electropherogram of a standard protein ladder separation with SDS containing buffer and laser-induced fluorescence detection. Bousse et al., Anal. Chem. 2001, 73, 1207– 1212. Čipy: detektory elektrochemické proud napětí konduktivita optické absorbance fluorescence MS Elektrochemická detekce pro mikrokolonové separace 4 1 µM bromide, chloride, nitrate, sulphate and oxalate. Bezkontaktní vodivostní detekce anorganických aniontů Lab on a chip, 1, 1-6 (2001) Detection on a micromachined electrophoretic separation device may be carried out amperometrically with a single electrode. In this case the electrophoretic ground electrode serves additionally as pseudo-reference and counter electrode. 5 Chiral separation of neurotransmitters Normetanephrine, Methoxytriamine and Metanephrine on chip Electrochemical Gas-Sensors with High Sensitivity Amperometric detection of acetaldehyde and ethanol in steps of 25 ppb Titration curves and calibration plot for different ammonia concentrations Coulometric Microtitrator Optické detektory pro separace na čipu Verpoorte „Chip vision – optics for microchips“ Lab Chip, 2003, 3, 42N–52N Absorpční detektor pro CE (a) Cross-sectional diagram of a pigtail absorption detector for capillary electrophoresis. The fused-silica capillary is located at the centre of the diagram, and is sandwiched between two slits, that are 50 mm 3 500 mm wide. (b) Photograph showing a GRIN lens pigtailed to an LED. The cylindrical lens is visible within the LED body, where it was fixed with refractive index matching (RMI) glue. (c) Schematic diagram of a flow cell, which was formed by precision manual drilling in the body of an LED. H: entrance/exit channels; F: optical fibre leading to a photodiode; P: opaque PEEK sleeve; C: emitting chip; L: LED. Verpoorte Lab Chip, 2003, 3, 42N–52N Absorpční detektor Top and cross-sectional views of the silicon flow cell. Verpoorte Lab Chip, 2003, 3, 42N–52N 6 LIF na čipu pro CE LIF = laser induced fluorescence konfokální detekce čip místo kapiláry LIF detektor pro čip Verpoorte Lab Chip, 2003, 3, 42N–52N True single molecule sequencing (sequencing by synthesis) HeliScope™ www.helicosbio.com Detekce LIF v sekvenování DNA štěpení DNA připojení fluorescen- čního primeru Imobilizace na povrch s polyT záznam pozic odstranění fluoroforu sekvenační reakce s fluoreskujícím dNTP záznam pozic odstranění fluoroforu …a znovu krok 5 s ostatními dNTP (kredit: F. Foret) 1 2 3 4 5 6 7 Prameny Y. C. Lim, A. Z. Kouzani, W. Duan: Lab-on-a-chip: a component view Microsyst Technol 16,1995–2015, 2010 M. Lazar, J. Grym, F. Foret „Microfabricated Devices: A New Sample Introduction Approach To Mass Spectrometry“ Mass Spectrom Rev. 2006, 25, 573– 594 Čipy v hmotnostní spektrometrii 7 Mikrometody v hmotnostní spektrometrii MALDI Laurell, T.; Nilsson, J.; Marko-Varga, G. Trends Anal. Chem. 2001, 20, 225-231. Čipy pro ESI MS Microchip configurations with inserted ESI needles (A) Schematic representation of the microchip configuration forMSinfusion with an inserted capillary that acts as an electroosmotic pump and transfer line between the chip and ESI interface. Figeys et al. Anal Chem 70:3728–3734.); (B) Schematic representation of the microchip configuration for CE separation and MS analysis using a capillary ESI emitter. Li J, Anal. Chem. 2000, 72, 599– 609. Emitor pro ESI MS Microchip with integrated electrospray emitter. (A) SEM image of a microfabricated silicon electrospray nozzle; (B) Schematic representation of a complete chip handling and fluid delivery system. Schultz et al. Anal. Chem. 2000, 72, 4058–4063. Emitor pro ESI MS SEM image of a planar ESI emitter fabricated from negative SU-8 photoresist. Le Gac S, Arscott S, Rolando C. Electrophoresis 2003, 24, 3640–3647. Příklady analytických čipů • Agilent/Caliper Čip pro HPLC-MS: zakoncentrování vzorku, RPLC a ESI Sample in Stator Rotor Fluid connections Waste Nano LC Pump Nano- electrospray tip Sample enrichment column LC Column Side View Top View 6 port rotary valve Prototype chip/valve setup Top view 8 Paralelní ESI MS Liu H.H., Felten C., Xue Q.F., Zhang B.L., Jedrzejewski P., Karger B.L., Foret F. Development of multichannel devices with an array of electrospray tips far high-throughput mass spectrometry. Anal Chem 2000 72:3303–3310. MALDI MS z čipu www.gyros.com Čip pro paralelní CE – MALDI MS společný kapalinový spoj separační kanálky infúzní kapiláry do sondy kapiláry pro dávkování vzorků z mikrotitrační destičky Čip CE – MALDI MS vs. konvenční zařízení Techniky levitace • slouží k eliminaci „krusty“ kolem kapalného vzorku za účelem minimalizace sorpce vzorku • použití v bioanalytické chemii – biolog. kompatibilita a snadné ovládání, nízké náklady na pořízení přístroje a ovládání, snadný přístup ke vzorku, stabilní poloha vzorku – splňuje pouze akust. levitace • Druhy levitace: - optická, elektrostatická, aerodynamická, akustická - hybridní (aerodynamická akustická, elektrostatická aerodynamická, elektrostatická akustická) - Výhody akust. levitace: nevyžaduje speciální vlastnosti vzorku (např. el. náboj event. index lomu vzorku, - Takřka všechny vzorky (pevné vzorky, kapaliny) mohou být levitovány. Experimentální uspořádání 9 Experimentální uspořádání Akustická levitace Akustická levitace Extrakce v levitující kapce CE s detekcí v levitující kapce CE s detekcí v levitující kapce 10 Akust. Levitace RTG Analýza