Úloha č. 1
IZOLACE DNA NA KOLONKÁCH


VYUŽITÍ
§pro DNA analýzu v lékařském výzkumu, klinické DNA diagnostice
§laboratoře s využitím molekulárně-biologických metod:
• klinické
• veterinární
• potravinářské
• zemědělské
•

METODY IZOLACE DNA
§velké množství
§komerčně dostupné izolační metody
•
• (izolace na kolonkách nebo pomocí paramagnetických částic)
•
• výhody: urychlení práce
• standardizace práce, čistoty a výtěžků
•
•

IZOLACE DNA NA KOLONKÁCH
§princip: selektivní vazba DNA na membránu obsahující silikátové částice (kolonka).
•
•
•
§k vazbě dochází v přítomnosti:
• chaotropní soli (Guanidin HCl), která vytěsňuje z molekul DNA molekuly vody, čímž uvnitř DNA
potlačuje jiné interakce (hydrofobní, vodíkové vazby) než iontové
• a 10% isopropanolu nebo etanolu, který DNA částečně vysráží
fig13_4

Fig. 3



POSTUP
§stěr z bukální sliznice vatovým tamponem
•
§izolace DNA:
– TD1 – lyzační roztok (Guanidine HCl/Tween) + proteináza K
– B2 – 100% ethanol
– B3 – promývací roztok (Ethanol/Guanidine HCl)
– B4 – promývací roztok (Ethanol, Tris, NaCl)
– B5 – eluční roztok (10 mM Tris-HCl)

STANOVENÍ KONCENTRACE
§UV spektrofotometr
•
§princip: DNA absorbuje UV záření při vlnové délce 260 nm
• díky aromatickým strukturám bazí nukleových kyselin.
•
§absorpce je vyjádřena pomocí absorbance:
• podle Lambert-Beerova zákona platí, že
•
• A = ε . c . l

STANOVENÍ ČISTOTY
§kontaminace: organické látky
§princip: proteiny absorbují UV záření při vlnové délce 280 nm díky aromatickým AMK (tyrosin,
fenylalanin)
• poměr absorbancí DNA/protein (260/280) = míra znečištění proteiny
• u čistého vzorku v rozmezí 1,8 – 2,0
•
§organické látky (polysacharidy, polyfenoly, močovina, thiokyanáty, EDTA) absorbují při 230 nm
• poměr absorbancí DNA/organická látka (260/230) = míra znečištění organickými látkami
• u čistého vzorku v rozmezí 1,8 – 2,0
•
•