Úloha č. 4
Izolace DNA z klíštěte, detekce Borrelia burgdorferi sensu lato pomocí RealTime PCR, nested PCR


•Klíště obecné (ixodes ricinus)
•
•
•
•
•
•
•
•
•               Borrelia burgdorferi
•
tick_ixodes_ricinus_1292.jpg eb7157cd-dd8b-424b-b444-6933583fe304.jpg lyme.jpg

Životní cyklus
rocky-tickcycle.jpg


LYMESKÁ BORELIÓZA
•V ČR nejčastější onemocnění přenášené klíšťaty.
•
•Příznaky
•
•Diagnostika
•
•Léčba
•
•
•

PŘÍZNAKY
1.stádium (lokalizovaná infekce – dny až měsíce):
•erythema migrans – jediný typický příznak; přítomen u cca 80 % pacientů.
•kožní změny
•chřipkové stavy – horečka, slabost, únava, bolest svalů, kloubů
•modročervený uzlík – 1-5 cm velký (lalůček, nos, prsní bradavka)
-
2.stádium (generalizovaná infekce – týdny až měsíce)
•cca u 15 % nemocných
•bolesti hlavy, ztuhlost šíje, poruchy citlivosti, hybnosti, obrna, bolest zad, končetin, hrudníku
•značná únava
•srdeční obtíže
•
403px-Erythema_migrans_-_erythematous_rash_in_Lyme_disease_-_PHIL_9875.jpg
borrelial_lymphocytoma.jpg

PŘÍZNAKY
3.
3.Stádium (chronické infekce – měsíce až roky)
• zánět mozku, míchy, postižení zrakového nervu
•Atrofie kůže
•Postižení kloubů
•
•
•
•

DIAGNOSTIKA
•Nespecifické příznaky ztěžují diagnostiku
•
•Laboratorní testy:
–ELISA – detekce sérových protilátek; nepříliš spolehlivé, možnost falešné negativity i pozitivity
vzorku.
–Western Blot – detekce specifických protilátek; přesnější a spolehlivější, možnost falešné
negativity.
–PCR – detekce DNA borrelií; vysoce citlivá, záleží na fázi onemocnění – lokalizace borrelií.
–
•Optimální je kombinace více metod

LÉČBA
•Antibiotika (doxycyklin, amoxicilin, sumamed, erytromycin, ceftriaxon) .
•V časném stádiu je léčba účinná, dá se předejít chronickým potížím a přestupu do vyšších stádií.
Délka léčby antibiotiky:
1. stádium (časná infekce) - délka léčby 14 dnů
2. stádium (akutní zánět pohybového systému) - 21-28 dnů
3. stádium (chronická artritida) - 28 dnů

POSTUP
•Izolace DNA z klíštěte
•
•Detekce borrelií – RealTime PCR
•
•Příprava na sekvenaci – nested PCR

RealTime PCR
•Detekce PCR produktů v reálném čase na základě fluorescence hybridizačních resp. hydrolyzačních
sond.
•
•Hlavní výhoda oproti klasické PCR je možnost kvantifikace vzorku, vysoká specifita a senzitivita,
časová úspora.
•
•Využití:
–Výzkum – kvantifikace genové transkripce, detekce  organizmů, detekce polymorfizmů.
–Klinická diagnostika – detekce patogenů, genetických abnormalit.

RealTime PCR
•Detekce borrelií – využití molekulárního majáku (molecular beacon)


RealTime PCR
•Vyhodnocení
•
Bez názvu.jpg

Nested PCR
•dvoukroková PCR – 2 sady primerů (vnější a vnitřní), vysoce specifická amplifikace.
•
•využití:
•kontaminace vzorku – selekce požadovaného úseku DNA
•dodatečná amplifikace vzorků s nízkým výtěžkem po 1. PCR
•
•
•
• nutné pro sekvenační reakci