Úloha č. 5
URČENÍ BAKTÉRIE RODU BORRELIA POMOCÍ DNA SEKVENACE


SEKVENACE DNA
• sekvenační techniky:
•
Ø 1977 Maxam-Gilbertova metoda
Ø
Ø 1980 Sangerova metoda
•automatizovaná varianta
•
Ø metody nové generace
•pyrosekvenování, SOLID, SOLEXA
•
•

SANGEROVA METODA
•DNA polymerasa 2‘-deoxynukleosidtrifosfáty (dNTP)
•       primer
•
•                 2‘,3‘-dideoxynukleosidtrifosfáty (ddNTP)

SANGEROVA METODA
využití ddNTP


SANGEROVA METODA
průběh a detekce


AUTOMATIZOVANÁ VARIANTA
•varianta enzymatického sekvenování DNA
•amplifikace DNA na termocykléru (PCR) a elektroforetická separace fragmentů na sekvenátoru
•syntéza DNA probíhá v jedné reakci
• značení a detekce: ddNTP
• čtyři různé fluorescenční značky
•
•
•
•
•
•produkty se liší o 1 bázi

Genetický analyzátor
         ABI 3130
•
C:\Documents and Settings\HP\Plocha\Cvika 2011\ABI3130xl.jpg C:\Documents and
Settings\HP\Plocha\Cvika 2011\sekv3.jpg

DETEKCE PRODUKTŮ



POSTUP
•přečištění ExoSAP
•
•sekvenační reakce
•
•přečištění magnetickými kuličkami
•
•sekvenace
•
•vyhodnocení výsledků a určení druhu borrelie