Úloha č. 1 Izolace DNA na kolonkách ÚVOD Izolace DNA z jakéhokoliv materiálu je dnes základním postupem v laboratořích zabývajících se molekulárně-biologickými metodami. Izolace DNA je prováděna nejen v klinických laboratořích, ale například také v laboratořích veterinárních, potravinářských (např. testování GMO) a zemědělských. Nejvíce DNA analýz je v současné době prováděno v rámci lékařského výzkumu a v rámci klinické DNA diagnostiky. Proto se budeme ve většině dalších metodik v rámci Cvičení z DNA diagnostiky držet postupů používaných v klinických laboratořích. Při DNA diagnostice je dnes využíváno především metody řetězové polymerázové reakce v podobě běžné PCR, nested PCR nebo RealTime PCR. Pro metodu PCR je třeba čisté a nefragmentované DNA o určené koncentraci. Při izolaci DNA je třeba z klinického materiálu odstranit veškeré inhibitory PCR reakce, kterými jsou například hemoglobin a další proteiny, antibiotika, polysacharidy, atd. Za účelem izolace DNA bylo vypracováno nespočet metod, nicméně v klinických provozech je z důvodu urychlení práce, standardizace práce, standardizace čistoty a výtěžků používáno komerčně dostupných izolačních metod. Mezi nejčastěji používané izolační principy patří izolace na kolonkách nebo pomocí paramagnetických částic. Izolace na kolonkách je založena na principu selektivní vazby DNA a/nebo RNA o určité délce na vrstvu drceného borosilikátového skla, která se nachází mezi dvěma fritami na kolonce. K vazbě dochází v přítomnosti tzv. chaotropní soli, která vytěsňuje z molekul DNA/RNA molekuly vody, čímž potlačuje jiné než iontové interakce a v přítomnosti asi 10% isopropanolu nebo etanolu, který DNA/RNA částečně vysráží. Mezi tzv. chaotropní soli patří například guanidin hydrochlorid, který potlačuje vodíkové vazby a hydrofobní interakce uvnitř molekul DNA/RNA a/nebo proteinů. V rámci cvičení z DNA diagnostiky bude použit kit určený především k izolaci genomové DNA z plné krve. Jelikož ve cvičení nelze pracovat s lidskou krví, bude krev nahrazena stěrem z ústní sliznice. Ústní sliznice obsahuje velké množství živých buněk, které lze snadno a bezbolestně setřít sterilním tampónem. Stěr z ústní sliznice si provede každý student sám. Ke stěru bude použit sterilní odběrový tampón. U izolované DNA bude následně stanovena její koncentrace a čistota pomocí UV spektrofotometru. Měření vychází ze známého faktu, že aromatické struktury bází nukleových kyselin specificky absorbují UV záření určitých vlnových délek s maximem při 260 nm. Zároveň platí, že čím vyšší je absorpce záření, tím vyšší je koncentrace DNA a naopak. Tento vztah je vyjádřen v Lambert-Beerově zákoně pro absorbanci (bezrozměrná veličina): A = c . l . ϵ A – absorbance; c – molární koncentrace; l – délka kyvety resp. tloušťka vrstvy roztoku; ϵ – molární absorpční koeficient Při izolaci DNA se mohou do finálního roztoku rovněž dostat určitá množství dalších molekul obsažených v buňkách (proteiny, polysacharidy, polyfenoly apod.), které mohou inhibovat následné analýzy. Z těchto důvodů je vhodné vedle stanovení koncentrace DNA ve vzorku sledovat i jeho čistotu. Proteiny mají díky aromatickým aminokyselinám (fenylalanin, tyrosin) absorpční maximum při vlnové délce 280 nm. Poměr absorbancí DNA/protein (260/280) pak vyjadřuje míru znečištění proteiny. U čistého vzorku by se tento poměr měl pohybovat v rozmezí 1,8 – 2,0. Ve stejném rozmezí by se měl nacházet i druhý ukazatel znečištění vyjádřený poměrem absorbancí 260/230, který upozorňuje na možnou kontaminaci různými organickými látkami jako jsou polysacharidy, (poly)fenoly, močovina, thiokyanáty, EDTA apod. Absorpční maximum dsDNA (260 nm) Absorpční maximum proteinů (280 nm) Vlnová délka (nm) Absorbance PRACOVNÍ POSTUP Upozornění: Při práci vždy používejte rukavice. Veškerý materiál v laboratoři nutno považovat jako potenciálně infekční. Vyhněte se kontaktu reagencií s kůží. V případě kontaktu potřísněné místo omyjte důkladně vodou. Vyvarujte se požití součástí kitu. Reagencie označené jako hořlavé musejí být drženy v dostatečné vzdálenosti od otevřeného plamene nebo ohně. I. Odběr vzorku Materiál: sterilní odběrový tampon, kelímek s vodou 1. Nejméně 60 minut před odběrem nejezte a nepijte, výjimkou je pouze neslazená nesycená voda. 2. Před odebráním vzorku si umyjte ruce, vypláchněte si ústa čistou neperlivou vodou a polkněte případný zbytek slin nebo vody v ústech. 3. Vyjměte odběrový tampón ze zkumavky. 4. Štětičkou otírejte sliznice obou tváří včetně záhybů mezi dásněmi a vnitřní stranou tváří, a to pohybem dopředu a dozadu (jako při čištění zubů) a zároveň štětičkou otáčejte, aby byla využita její celá plocha. Ideální tlak je dosažen v okamžiku, kdy na vnější tváři ucítíte tlak zevnitř. Jednou štětičkou otírejte sliznice tváří přibližně po dobu 1 minuty. Pokud se vám v průběhu stěru tvoří sliny, polkněte je (setření slin je nežádoucí!). 5. Po odběru umístěte odběrový tampón do kelímku štětičkou nahoru a přistoupíte k izolaci DNA. Štětička odběrového tampónu nesmí za žádných okolností přijít do styku s ničím jiným než se sliznicí, z níž se vzorek odebírá!!! II. Izolace DNA Materiál: izolační kit, pipety, centrifuga, vodní lázeň, mikrozkumavky o objemu 1,5 ml a 2 ml, popisovače. Obsah kitu: Izolační kit UltraClean™ Blood Spin DNA - proteináza K - roztok B1 – lyzační - roztok B2 – ethanol - roztok B3 – promývací - roztok B4 – promývací - roztok B5 – eluční - kolonky ve 2 ml mikrozkumavkách - mikrozkumavky o objemu 2 ml Postup izolace DNA: Po celou dobu používejte ochranné rukavice! 1. Do připravených 2 ml mikrozkumavek napipetujte 400 µl roztoku TD1 a 10 µl proteinázy K. 2. Stěrovku vložte do označené mikrozkumavky a sterilními nůžkami odstřihněte štěteček. 3. Mikrozkumavky vložte do vodní lázně vytemperované na 56°C a inkubujte 20 min. Poté mikrozkumavky krátce stočte na centrifuze. 4. Sterilní pinzetou vyjměte štěteček a vyhoďte. Ke každému lyzátu přidejte 200 µl roztoku B2. Jemně zvortexujte a zcentrifugujte. 5. Přeneste veškerý obsah mikrozkumavky do kolonky. 6. Centrifugujte 1 min při 14 000 x g. 7. Přendejte kolonku do nové mikrozkumavky. 8. Do kolonky přidejte 500 µl roztoku B3. 9. Centrifugujte 30 sekund při 14 000 x g. 10. Vyjměte kolonku z mikrozkumavky, obsah mikrozkumavky vylijte do odpadu a vraťte do ní kolonku. 11. Do kolonky přidejte 500 µl roztoku B4. 12. Centrifugujte 30 sekund při 14 000 x g . 13. Vyjměte kolonku z mikrozkumavky, obsah mikrozkumavky vylijte do odpadu a vraťte do ní kolonku. 14. Znovu centrifugujte 30 sekund při 14 000 x g. 15. Opatrně vyjměte kolonku a přeneste ji do nové mikrozkumavky, aniž byste se dotkli roztoku B4 na dně původní mikrozkumavky. 16. Roztok B5 inkubujte asi 5 minut na vodní lázni při 65°C. Do středu kolonky napipetujte 50 µl roztoku B5 předehřátého na 65°C. 17. Centrifugujte 1 min při 14 000 x g. 18. Odstraňte kolonku a zavřete víčko mikrozkumavky. Genomická DNA je nyní připravena pro různé aplikace. III. Stanovení koncentrace a čistoty DNA Materiál: pipeta, izolovaná DNA, UV spektrofotometr (IMPLEN) Postup: 1) Naneste 3 µl PCR vody na sklíčko měrné kyvety a přiložte krycí víčko s Lid faktorem 10 a zmáčkněte tlačítko BLANK. 2) Sejměte víčko, otřete měrné plochy kyvety a víčka. 3) Naneste 3 µl vzorku na sklíčko měrné kyvety a přiložte krycí víčko s Lid faktorem 10 a zmáčkněte tlačítko SAMPLE. 4) Na displeji odečtěte a zapište si hodnotu koncentrace DNA a příslušné poměry absorbance.