Úloha č. 7 Sekvenace části genu pro laktázu: určení laktózové intolerance ÚVOD Laktáza je enzym vyskytující se v trávícím traktu, přesněji v kartáčovém lemu enterocytů. Zde štěpí disacharid laktózu (mléčný cukr) na dva jednoduché sacharidy glukózu a galaktózu, které pak trávící trakt dále využívá. Pokud laktáza chybí nebo má sníženou účinnost, zůstává laktóza nerozštěpená a buňky střevní sliznice ji nemohou vstřebávat. Laktóza se tak pak dostává i do dalších částí zažívacího traktu, kde je nadbytečná, což následně vyvolává zdravotní problémy. Střevo se snaží naředit svůj obsah a proto se do střevní dutiny začne sliznicí nasávat voda, což způsobí zvětšení objemu střevního obsahu, urychlení peristaltiky a průjem. Kromě toho se nenatrávená laktóza dostává do tlustého střeva, kde představuje potravu pro přítomné bakterie, které ji začnou kvasit. Tím vzniká mnoho produktů – plyny (methan, oxid uhličitý), organické kyseliny, které dráždí střevní stěnu a vyvolávají křeče a bolesti břicha, a vodík, který se vstřebává a je vydechován plícemi, čehož se využívá při diagnostice onemocnění zvaného laktózová intolerance. V současnosti trpí laktózovou intolerancí přibližně každý šestý člen populace, přičemž u jižních národů a u černé rasy bývá její četnost mnohonásobně vyšší než u obyvatelů severní Evropy. Četnost intolerance mléčného cukru stoupá s věkem, u předškolních dětí bývá vzácná, ve vyšším věku je její výskyt častější. Nejčastější příčinou nedostatku laktázy bývá geneticky podmíněné snižování produkce tohoto enzymu se stoupajícím věkem. Nazývá se adultní (dospělý) typ laktózové intolerance. Stává se také, že vznik intolerance laktózy způsobí poškození sliznice střeva jinými vlivy – ta se pak nazývá sekundární neboli získaná. Vzniká jako důsledek infekčních průjmových onemocnění, po užívání některých léků (antibiotik) a také při některých chronických onemocněních střeva, jako je Crohnova choroba nebo celiakie. Typicky vzniká u dětí v kojeneckém věku po infekčním průjmu způsobeném rotaviry, kdy se po pokusech o znovuzavedení mléka do jídelníčku dítěte objevují průjmy. Nedostatek enzymu je však pouze dočasný, se zhojením povrchu střevní sliznice se začne laktáza opět tvořit a dítě pak může pít mléko bez dalších negativních následků. Podezření na intoleranci laktózy se nejčastěji potvrzuje vodíkovým dechovým testem, který je založen na stanovení množství vodíku ve vydechovaném vzduchu po podání laktózy. Další variantou potvrzení diagnózy bývá určení pH průjmovité stolice, které bývá při laktózové intoleranci kyselé v důsledku vyššího obsahu organických kyselin. Lékař také může změřit hladinu cukru v krvi po podání laktózy, která bývá u laktózové intolerance málo zvýšená kvůli tomu, že nerozštěpením laktózy nevznikají jednodušší cukry, které by se vstřebaly ze střeva a glykémii by zvýšily. Nejméně používaným testem, zejména kvůli jeho náročnosti a invazivnímu charakteru, bývá přímé stanovení enzymu ve střevní sliznici. Lékař při endoskopickém vyšetření odstřihne malý kousek sliznice tenkého střeva a v ní se pak prokazuje přítomnost nebo nepřítomnost laktázy. Onemocnění se dá léčit omezením laktózy v jídelníčku, ve výjimečných případech je nutno výrobky s obsahem laktózy úplně vyloučit. Jelikož má většina postižených ve střevě aspoň malou aktivitu laktázy, nemá potíže po konzumaci malých množství výrobků s obsahem mléčného cukru. Ve cvičení budeme pomocí genetického analyzátoru ABI PRISM 3130 detekovat přítomnost či nepřítomnost jednobodového polymorfismu C13910T nacházejícím se v regulační oblasti genu pro laktázu, u kterého byla nalezena asociace s geneticky podmíněnou formou laktózové intolerance. PRACOVNÍ POSTUP I. PCR reakce Materiál: pipety, špičky, popisovače, mikrozkumavky (0,2 ml), termocyklér, reagencie pro PCR – KAPA mix, primery (5μM), PCR voda, DNA. Reakční směs pro PCR (20 μl/vzorek): *KAPA mix……………… 12,5 μl FLAC primer …………. 0,7 μl RLAC primer…………. 0,7 μl PCR voda……………... 10,5 μl *DNA……………………… 1,0 μl *KAPA2G Fast HotStart ReadyMix – obsahuje HotStart DNA polymerázu, PCR pufr, dnes (0,2mM), MgCl[2] (1,5 mM), stabilizátory. *DNA – použity izoláty z 1. cvičení Amplifikace fragmentů: - Mikrozkumavky vložte do termocykléru. Amplifikace bude probíhat dle následujícího programu: 94°C 2,5 min 94 °C 20 sek (denaturace) 40x 55 °C 20 sek (annealing) 72 °C 20 sek (extenze) 72°C 5 min (extenze) 10°C hold II. Analýza na agarózovém gelu - na připravený 1,5% agarózový gel naneste 10 µl amplifikované PCR směsi, přičemž do první jamky napipetujte 1,5 µl DNA standardu - elektroforetickou vanu připojte ke zdroji elektrického napětí a nechte proběhnout elektroforézu cca 30 minut při 90 V - poté vyjměte gel z elektroforetické vany a vložte jej do transiluminátoru ke konečnému vyhodnocení III. Přečištění amplifikované DNA pomocí ExoSAP Materiál: Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP), Exonuclease I E.coli (Exo), DNA, pipety, špičky, popisovače, mikrozkumavky (0,2 ml), termocyklér Do zkumavky napipetujte následující reagencie, krátce promíchejte na vortexu a stočte, poté vložte do termocykléru. Reakční směs pro přečištění (7 ml/vzorek): SAP…………… 1,0 μl Exo…………… 0,5 μl *DNA………… 5,5 μl *DNA – PCR produkty Teplotní protokol pro přečištění: 37 °C 15 min 80 °C 15 min 10 °C hold IV. Sekvenační reakce Materiál: BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, pipety, špičky, popisovače, mikrozkumavky (0,2 ml), termocyklér, FLAC primer, PCR voda, DNA Do zkumavky napipetujte následující reagencie, krátce promíchejte na vortexu a stočte, poté vložte do termocykléru. Reakční směs pro sekvenační reakci (10 ml/vzorek): sekvenační mix ………… 2,0 μl sekvenační pufr ………… 2,0 μl FLAC primer ……………… 0,6 μl PCR voda……………………. 2,4 μl *DNA………………………… .. 3,0 μl * DNA – vzorek po přečištění ExoSAP Teplotní protokol pro sekvenační reakci: 96 °C – 1 min 96 °C – 10 sek (denaturace) 35x 50 °C – 5 sek (annealing) 60 °C – 2 min (extenze) 10 °C – hold V. Přečištění po sekvenační reakci Materiál: Chemagic SEQ Pure Kit, magnetický stojan, pipety, špičky, popisovače, mikrozkumavky (1,5 ml), vodní lázeň, PCR voda, DNA Postup viz úloha č.5 VI. Analýza na sekvenátoru ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer Vzorky napipetujte do destičky na sekvenaci a spusťte sekvenátor. Pro analýzu a vyhodnocení použijeme programy 3130 Data Collection v3.0 a Sequencing Analysis 5.3.1.