C7188 Úvod do molekulární medicíny 5/12 Moderní metodické přístupy v molekulární medicíně III GENOMIKA III, PROTEOMIKA Ondřej Slabý, Ph.D. Masarykův onkologický ústav CEITEC Lékařská fakulta Masarykovy univerzity © Ondřej Slabý, 2009 logo_MOU GS011558 Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 2 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 3 © Ondřej Slabý, 2009 •Současná hybridizace dvou vzorků DNA značených odlišnými fluorochromy na normální metafázní chromozomy fixované na podložním skle –DNA pacienta (nádorová) značena zeleně (FITC) –kontrolní DNA (DNA zdravého jedince) značena červeně (TRITC) Nelze detekovat balancované translokace a inverze, obecně změny při nichž nedochází ke kvantitativní změnám Komparativní genomová hybridizace (CGH) nebalanct Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 4 © Ondřej Slabý, 2009 © Ondřej Slabý, 2009 Princip chromozomové CGH 5 4b 4a 3 2a2 2b2 2a2 2a1 1a 1b 1c Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 5 © Ondřej Slabý, 2009 Výsledek chromozomové CGH cgh_fin cgh_multiselect •vizualizován pomocí fluorescenčního mikroskopu •pro každý fluorochrom je obraz snímán kamerou do počítače •speciální softwarový program změří intenzitu obou fluorochromů podél každého chromozomu •výsledkem analýzy: CGH profil - poměr intenzit signálů obou fluorochromů –poměr 1 = nedošlo k žádné kvantitativní změně –poměr <0,75 = delece –poměr >1,25 = duplikace, amplifikace Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 6 © Ondřej Slabý, 2009 6 Genomová array CGH (aCGH) Minulost – cDNA arrays for CGH Původ genomových sekvencí DNA pro aCGH YAC [Yeast Artificial Chromosomes] (0,2-2 Mb) BAC [Bacterial Artifial Chromosomes] (300 kb) PAC [P1-derived Artificial chromosomes] (130-150 kb) plazmidů (30-45 kb) Současnost – oligonukleotidové arrays CGH (oaCGH) Rozlišovací schopnost array-CGH závisí právě na typu použitého vektoru, V každém případě je však řádově vyšší než u chromozomové CGH!!! tiling arrays – překrývající se próby, 10 bp © Ondřej Slabý, 2009 Strana 7 Úvod do molekulární medicíny 5/12 Genomová array CGH (aCGH) Úvod do molekulární medicíny 5/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 8 kolorektální karcinom Karcinom hrdla děložního Uterine Cancer Colorectal Cancer CGH v onkologii 20 primárních tumorů 20 primárních tumorů Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 9 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 10 © Ondřej Slabý, 2009 Za geneticky polymorfní je považován znak s nejméně dvěma geneticky podmíněnými variantami v jedné populaci, které se nachází v takových frekvencích, že i zřídkavá má frekvenci alespoň 1%. SNP = single nucleotide polymorphism, jsou jednonukleotidové polymorfní znaky Celogenomové mapy SNPs jsou dostupné ve webových databázích (~6 milionů) Mezi lidmi je přibližně 99,9% shoda v sekvenci DNA Zbývajících 0,1% nás činí jedinečnými (jak vypadáme, nemoci, kterými budeme trpět, …) Přibližně 1 SNP per 1.000 bp 90% genů obsahuje alespoň 1 SNP SNP čipy Affymterix SNP čipy Mapping 10K array => Mapping 100K array => Genome-wide Human SNP array 5.0 (500K) => Genome-wide Human SNP array 6.0 (1.8 million) Umožňuje: Detekci SNP Počet kopií daného genu (amplifikace, delece, aneupoildie) Ztráta heterozygotnosti Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 11 Affymterix SNP čipy • HJ dané alely: AA, AB, BB • Intenzita signálu: počet kopií Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 12 Pro každou alelu 5 sond + 5 párových sond s nukleotidovou záměnou (např. v pozici -4) Úvod do molekulární medicíny 5/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 13 Úvod do molekulární medicíny 5/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 14 © Ondřej Slabý, 2009 ChIP-on-chip technologie kombinace chromatinové imunoprecipitace a čipové technologie Discover protein/DNA interactions!! Např. Agilent Technologies… To answer: which genes are regulated by a known TF/DNA binding protein Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 15 © Ondřej Slabý, 2009 Technologie čipů k detekci methylace CpG oblastí Např. Agilent Technologies… Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 16 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 17 © Ondřej Slabý, 2009 Technologie exonových čipů Umožňuje detekci, i nových, sestřihových variant známých genů Affymetrix GeneChip® Human Exon 1.0 ST Array Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 18 © Ondřej Slabý, 2009 biome, cellomics, chronomics, clinomics, complexome, crystallomics, cytomics, cytoskeleton, degradomics, diagnomicsTM, enzymome, epigenome, expressome, fluxome, foldome, secretome, functome, functomics, genomics, glycomics, immunome, transcriptomics, integromics, interactome, kinome, ligandomics, lipoproteomics, localizome, phenomics, metabolome, pharmacometabonomics, methylome, microbiome, morphome, neurogenomics, nucleome, secretome, oncogenomics, operome, transcriptomics, ORFeome, parasitome, pathome, peptidome, pharmacogenome, pharmacomethylomics, phenomics, phylome, physiogenomics, postgenomics, predictome, promoterome, proteomics, pseudogenome, secretome, regulome, resistome, RNome, ribonome, ribonomics, riboproteomics, saccharomics, secretome, somatonome, systeome, toxicomics, transcriptome, translatome, secretome, unknome, vaccinome, variomics... -omics Mania An omics is a neologism referring to a broad field of study in biology, ending in the suffix ''-omics'' such as genomics, proteomics or Interactomics. The related neologism '''omes''' are the objects of study of the field such the genome or proteome, respectively (''omes'' stems from the Greek for 'all', 'every', 'whole' or 'complete'). Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 19 © Ondřej Slabý, 2009 Different -omics sciences describe many levels of biomolecular organization – but if used in isolation may give misleading inferences about the system!!! Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 20 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 21 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 5/12 JEDEN GENOM, DVA PROTEOMY Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 22 © Ondřej Slabý, 2009 From 220 publications in the previous millennium (‘94-’99) To 21,350 (!!!) publications in this millennium (‘00-’05) stevecoast_1_small proteomics 886,000 hits (2004) 4,700,000 hits (2005) genomics 2,070,000 hits (2004) 16,000,000 hits (2005) PROTEOMIKA Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 23 © Ondřej Slabý, 2009 Co je to proteomika? Proteomika je obor, který se zabývá systematickou analýzou proteinů z hlediska jejich identity, množství a funkcí Proteom Genom ØSouhrn všech proteinů v daném organismu ØLidské tělo obsahuje miliony proteinů ØExprese proteinů v rámci jednoho organismu se liší ØSouhrn všech genů v daném organismu ØLidský genom obsahuje 20-25.000 genů ØGenom je konstantní celek Exprese +posttranslační modifikace +alternativní sestřih +alternativní zavinutí Proteomika Genomika MarcWilkins, 1994 PROTEiny exprimované genOMem Nárůst diverzity proteinů ØPosttranslační modifikace 1.Připojení funkčních skupin (acetát, fosfát, lipidy, cukry) 2.Modifikace amino skupin 3.Strukturní změny (tvorba disulfidických vazeb, proteolytické štěpení) ØAlternativní sestřih ØAlternativní zavinutí gene expression Posttranslační modifikace Alternativní zavinutí Alternativní sestřih Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 24 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 25 © Ondřej Slabý, 2009 Přístupy k proteomickému studiu Podle cíle: proteomika analytická, strukturní, funkční, … Podle způsobu provedení: proteomika diferenční, high-throughput… High-throughput proteomika je zaměřena na rychlé získávání údajů o přítomnosti bílkovin, což je důležité zejména pro screeningové účely ve zdravotnictví, zemědělství, kontrole potravin atd. High-coverage proteomika se zabývá získáváním údajů o sekvenci aminokyselin včetně post-translačních modifikací bílkovin scílem co nejvyššího pokrytí primární struktury (tj. stanovením pořadí co nejvyššího počtu aminokyselinových zbytků vbílkovině), což je důležité při studiu role bílkovin v životních procesech. Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 26 © Ondřej Slabý, 2009 Funkční proteomika se zabývá nejen funkcí bílkovin, ale zejména studiem komplexních biologických procesů, jejichž pochopení má zásadní význam pro studium vývoje organismu či mechanismu a léčby nemocí. Přístupy k proteomickému studiu Shotgun proteomika je obecný postup pro identifikacebílkovin, kdy je neseparovaná směs bílkovin nejprve enzymově rozštěpena na směs peptidů, které jsou následně separovány vhodnou metodou (nejčastěji HPLC) a potom sekvenoványtandemovou MS (často jsou využívány i nespecifické enzymy např. Proteinasa K). Úvod do molekulární medicíny 5/72 Strana 27 © Ondřej Slabý, 2009 Obecné schéma klasického proteomického experimentu Separace směsi bílkovin Výběr proteinů pro indentifikaci Štěpení vybraných roteinů a čištění peptidů Získání hmotnostních spekter Identifikace proteinů 2D-elfo, chromatografie LC, a jejich kombinace Enzymatické či chemické štěpení spotů nebo LC frakcí, čištění Měření přesné hmotnosti peptidů případně jejich fragmentů Porovnání hmotnostní sady peptidů s údaji dostupnými v databázích. Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 28 © Ondřej Slabý, 2009 Močovina, thiomočovina – chaotropní činidlo, zvýšení rozpustnosti, denaturace bílkovin Redukčníčinidlo(DTT) – redukce disulfidickýmůstků Příprava vzorku pro proteomické analýzy Analýza „subproteomů“ cytoplasma, ribosomy: diferenciální centrifugace membránová frakce: diferenciální centrifugace, extrakce detergenty (TX-114) nebo extrakce Na2CO3 Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 29 © Ondřej Slabý, 2009 Dvojrozměrná gelová elektroforéza (2D-ELFO) – SEPARACE IEF Celkový náboj proteinu(net charge) je součtem všech jeho negativních i pozitivních nábojů. Kyselé a zásadité skupiny jsou v protonovány a deptrotonovány v závislosti na pH okolí. Amfoterní molekula (bílkovina) v elektrickém poli v gradientu pH migruje do bodu, kde je její celkový náboj rovný nule. pH tohoto bodu odpovídá izoelektrickému bodu (pI) dané bílkoviny. SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfat–polyakrylamidová elektroforéza elektroforéza) Bílkoviny se rozdělujína základě jejich MW Záporně nabité SDS tvoří komplexy s bílkovinami a stíní náboje proteinu (1,4g SDS :1g proteinu). SDS uděluje proteinům uniformní náboj na jednotku hmotnosti Problémy s MS Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 30 © Ondřej Slabý, 2009 2D-ELFO LIMITACE 2D-ELFO!!!! Bílkoviny s extrémním pI Bíloviny nad 150 kDa Ohromný koncentrační rozsah (ng/l až g/l) Membránové(hydrofobní) bílkoviny Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 31 © Ondřej Slabý, 2009 Dvojrozměrná gelová elektroforéza (2D-ELFO) Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 32 © Ondřej Slabý, 2009 Diferenciální dvojrozměrná gelová elektroforéza (2D-DIGE) VÝBĚR PROTEINŮ Strana 33 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 5/12 Softwarové vyhodnocení 2D-gelů Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 34 © Ondřej Slabý, 2009 Směs proteinů Jednotlivé proteiny Peptidy Hmotnostní spektra peptidů Identifikace proteinů 1. Separace 2D-PAGE 2. Izolace Štěpení trypsinem 3. Hmotnostní analýza Hmotnostní spekroskopie 5. Porovnání s databází 4. Sekvenční analýza Fragmentace peptidů Sekvence peptidů Schéma – shrnutí klasického proteomického experimentu Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 35 © Ondřej Slabý, 2009 Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectometry - MS) IDENTIFIKACE Separace látek podle rozdílů hmotnosti (m) a náboje (z) s využitím elektrického / magnetického pole. Určovanou fyzikální veličinou je podíl hmoty a náboje (m/z), při znalosti náboje umožňuje určit molekulovou hmotnost. Výsledné hmotnostní spektrum → grafické znázornění četnosti iontů na hodnotě m/z IONTOVÉ ZDROJE Potřeba vysušení a ionizace analyzovaných molekul - měkké ionizační techniky (ESI, MALDI) → měření makromolekulárních látek (proteiny, lipidové komplexy, polysacharidy) Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 36 © Ondřej Slabý, 2009 Techniky ionizace - elektrospray (ESI) jemná technika ionizace, nezpůsobuje fragmentaci analytu vzorek rozpuštěn v těkavém organickém rozpouštědle rozprašován pomocí nabité mikrostříkačky odpařování rozpouštědla → molekulární ionty vstupují do spektrometru Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 37 © Ondřej Slabý, 2009 Techniky ionizace – matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Techniky ionizace–Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) maldi Smíchání vzorku s matricí vysušení na kovové destičce Matrice (kyselina nikotinová, dihydroxybenzoová) - absorbuje energii laseru - usnadňuje odpaření - předává náboj analytu Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 38 Typy analyzátorů MS – nejjednodušší Time of Flight (TOF) Urychlení iontů v elektrickém poli o definovaných vlastnostech m/z lze určit z doby letu iontu trubicí analyzátoru Další typy analytátorů – IT (ion trap-iontová past) Q3 (trojitý kvadrupól © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 39 © Ondřej Slabý, 2009 Peptidové mapování (Peptide Mass Fingerprinting – PMF, MS a MS/MS) Identifikace proteinů z roztoku a gelu Srovnání MS peptidového spektra s informacemi v databázích (AMK sekvence → teoretické štěpy) Interpretace MS dat Programy : Mascot, ProteinProspector Databáze: NCBI Swissprot MALDI-TOF Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 40 © Ondřej Slabý, 2009 Tandemová hmotnostní spektrometrie sekvenování peptidových fragmentů kvantifikace peptidů v MS módu: SILAC (Stable isotope labeling by amino acids in cell culture) kvantifikace peptidů v MS/MS módu: iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation) Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 41 © Ondřej Slabý, 2009 Post Source Decay (PSD) Při vyšší energii laseru → fragmentace peptidu (kolize mezi ionty analytu) Peptide fragment Sequencing- metoda pro sekvenování peptidů Tandemová hmotnostní spektrometrie sekvenování peptidových fragmentů vícekroková separace na základě m/z (multiple MS) -fragmentace určitého iontu: Post Source Decay (PSD), Colission Induced Disociation (CID) - fragmentace při kontaktu s inertním plynem (dusík, helium) v kolizní cele 400px-MS_MS ProteinChips and SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization) Kvantifikace proteinů byla definována na počátku devadesátých let 1)je rozšířením MALDI-TOF-MS 2metoda desorpce a ionizace netěkavých látek 3) měření proteinů v lineárním módu aktivní účast povrchu čipu při extrakci, prezentaci a strukturní modifikaci daného vzorku Rozdíly mezi metodami MALDI a SELDI 1)v prvotním zpracování samotného vzorku (inertní versus aktivní povrchy) 2)softwarové vyhodnocení získaných dat (hledání biomarkerů) Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 42 © Ondřej Slabý, 2009 Proteinové profily získané metodou SELDI umožňují rozdělit pacientky s karcinomem prsu do skupin analogicky jako u DNA čipů Brožková et al., 2008 Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 43 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 44 - Protilátkové microarrays : kvantitativní array vazba proteinu na imobilizovanou protilátku → detekce sendvičovou metodou (fluorescenčně značená protilátka) - Reverzní array : spotované lyzáty probované vždy jednou protilátkou Funkční array – spotované purifikované proteiny probované fluorescenčně značenou látkou (protein, DNA, jiné biologicky aktivní molekuly) array_image Proteinové arrays Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 45 Tkáňové arrays (Tissue MicroArrays - TMA) Molekulární epidemiologie – definice a vymezení oboru, identifikace molekulárních rizikových faktorů vzniku a rozvoje onemocnění, analýza vztahu molekulárních faktorů a vlivů prostředí na rozvoj nádorového onemocnění, význam molekulární epidemiologie u karcinomu plic a kolorektálního karcinomu Molekulární farmakologie I – cílená léčba – vývoj nových léčiv = identifikace nových molekulárních cílů, vysokovýkonný screening, tkáňové kultury, transgenní zvířecí modely, poměr rizik a prospěchu, ekonomická a etická hlediska při výběru identifikovaných cílu a vývoji nových léčiv Náplň příští přednášky Take home Komparativní genomová hybridizace (CGH) Genomová array CGH (aCGH) SNP čipy ChIP-on-chip technologie Technologie čipů k detekci methylace CpG oblastí Technologie exonových čipů Proteomika Obecné schéma klasického proteomického experimentu Dvojrozměrná gelová elektroforéza (2D-ELFO) Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectometry – MS, ISE, MALDI, SELDI, TOF, tandemová MS) Proteinové arrays Tkáňové arrays 1) 1) Strana 46 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 5/12 Strana 47 © Ondřej Slabý, 2009 Dotazy? Úvod do molekulární medicíny 5/12