C7188 Úvod do molekulární medicíny 8/10 MOLEKULÁRNÍ FARMAKOLOGIE II GENOVÁ TERAPIE PREIMPLANTAČNÍ DIAGNOSTIKA Ondřej Slabý, Ph.D. Masarykův onkologický ústav CEITEC Lékařská fakulta Masarykovy univerzity © Ondřej Slabý, 2009 logo_MOU GS011558 Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 3 Klinické hodnocení nových léčiv Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 4 © Ondřej Slabý, 2009 © Ondřej Slabý, 2009 Klinické hodnocení nových léčiv I. fáze klinického hodnocení * První podání lidským subjektů * Prioritou je hodnocení bezpečnosti * Hlavním cílem je stanovení tzv. MAXIMÁLNÍ TOLEROVATELNÉ DÁVKY (MTD) * Stanovují se optimální dávkovací řežimy pro další fáze klinického zkoušení * Dalším cílem je popis tzv. BEZPEČNOSTNÍHO PROFILU PŘÍPRAVKU * Farmakokinetické analýzy * Charakteristické je zařazováni zdravých dobrovolníků (v případě vysoce toxických látek=cytostatika pacienti) * Počet zařazených subjektů 10-20 * Pro design je typické navyšování dávky obvykle ve skupinách 3 pacientů Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 5 © Ondřej Slabý, 2009 Klinické hodnocení nových léčiv II. fáze klinického hodnocení •Prioritou je hodnocení účinnosti léčby •Hlavním cílem této fáze je tedy neukončit je v případě slibné účinnosti a naopak ukončit je v případě průkazu účinnosti nedostatečné •Hodnocení bezpečnosti a tolerance •Výsledky této fáze jsou rozhodovacím bodem žadatele o registraci léčivého přípravku pro jeho testování v dalších fázích •Experimenty jednoramenné a dvojramenné •Zařazováni jsou pacienti splňující vstupní kriteria (diagnóza, pokročilost onem.) •Počet subjektů 20-200 •Léčivo je podano soubrou a vyhodnocen podíl respondérů, pokud neodpovídá předpokladu je studie ukončena, v opačném případě zařazeni další Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 6 © Ondřej Slabý, 2009 5 Strana 3 © Ondřej Slabý, 2009 III. fáze klinického hodnocení •Z předchozích fází máme informace o bezpečnosti, dávkování a účinnosti •Cílem této fáze je prostřednictvým řízeného experimentu přímé srovnání bezpečnosti a účinnosti hodnoceného přípravku s kontrolou, kterou může být placebo nebo aktuálně používaná nejlepší léčba. •Hlavním cílem je přinést data prokazující, že účinnosti a bezpečnost léčivého přípravku jsou stejné nebo lepší než u dosud použivaných přípravků •Zařazováni jsou pacienti splňující vstupní kriteria (diagnóza, pokročilost onem.) •Počet subjektů 100-1000 •Randomizace, paralelní, cross-over uspořádání IV. fáze klinického hodnocení •Hodnocení prováděna až po registraci daného přípravku a zahájení jeho používání v běžné léčebné praxi •Hlavní cíl ověřit vlastnosti léčivého přípravku v reálném prostředí v reálných populacích pacientů Klinické hodnocení nových léčiv Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 8 © Ondřej Slabý, 2009 Klinické hodnocení nových léčiv Randomizace je proces náhodného rozdělování subjektů do srovnávacích ramen klinického hodnocení (kompletní, bloková, stratifikovaná). Úvod do molekulární medicíny 8/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 9 Klinické hodnocení nových léčiv INTERIM ANALÝZA – plánované jednorázové nebo opakované statistické zpracování dat klinického hodnocení s předem jasně definovanými kritérii pro případné ukončení nebo pokračování experimentu v závislosti na vlastních výsledcích interim analýzy. ETICKÉ A EKONOMICKÉ DŮVODY ZASLEPENÍ – single blinding – zaslepena je pouze jedna strana subjekt hodnocení nebo investigátor double blinding – zaslepeni jsou subjekty hodnocení i investigátor triple blinding – zaslepen je i personál spravující data experimentu Zaslepení je prvek designu významně zvyšující jeho objektivitu. METANALÝZA – je metodika sofistikovaného zobecnění výsledků dvou a více nezávisle Provedených experimentů. Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 10 © Ondřej Slabý, 2009 Monoklonální protilátky •Emil von Behring – objev protilátek, terapeutický význam coby „magických střel či otrávených šipů“ •Paul Ehrlich zavedl pojem imunoterapie •1975 C.Milstein a G.F.Kohler popsali technologii tvorby MP V jedné hybridní linii spojili biologické vlastnosti B-lymfocytu tvořícího protilátky a nádorové buňky myelomové řady (tzv. hybridomová technologie) behringcartoon Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 11 © Ondřej Slabý, 2009 Příprava monoklonálních protilátek Nemodifikované myší mAb – pro lidský organismus jsou cizorodé a vyvolávají imunitní odpověď tj. tvorbu antimyších protilátek (tzv. HAMA), které vedou až k anafylaxi či sérové nemoci Humanizované mAb (chimerické humánní/myší) – připravují se spojením hybridomové a DNA rekombinantní technologie Variabilní úsek MP kódující antigenní specifitu je myší Konstantní úsek MP je z lidského imunoglobulinu Practical steps in monoclonal antibody production: 1) Immunize animal 2) Isolate spleen cells (containing antibody-producing B cells) 3) Fuse spleen cells with myeloma cells (e.g. using PEG - polyethylene glycol) 4) Allow unfused B cells to die 5) Add aminopterin to culture to kill unfused myeloma cells 6) Clone remaining cells (place 1 cell/well and allow each cell to grow into a clone of cells) 7) Screen supernatant of each clone for presence of the desired antibody. 8) Grow the chosen clone of cells in tissue culture indefinitely. 9) Harvest antibody from the culture supernatant. 10) (If you’re a biotech company) charge about $1,000-$2,000 per mg. Strana 14 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 8/12 Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 12 Struktura imunoglobulinu Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 13 © Ondřej Slabý, 2009 Typy monoklonálních protilátek Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 14 © Ondřej Slabý, 2009 Typy monoklonálních protilátek Protilátky nekonjugované (klasické / bispecifické – trifunkční) Protilátky konjugované Konjugované s imunotoxiny Konjugované s radionuklidem Konjugované s cytokiny Konjugované s cytostatiky Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 15 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 16 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 8/12 Klener et al, 2010 Biologické účinky navozené mAb Přímý účinek (indukce apoptózy, interference s receptorem a ligandem, ovlivnění účinnosti klasických cytostatik, dle charakteru antigenu) Účinek zprostředkovaný cytotoxickými buňkami (ADCC) Účinek zprostředkovaný komplementem Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 17 © Ondřej Slabý, 2009 Přehled mAb používaných v terapii nádorových onemocnění Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 20 © Ondřej Slabý, 2009 Strategie cílené léčby Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 18 © Ondřej Slabý, 2009 Cílená léčba: terapie cílená na nádorové buňky – inhibice proliferace Inhibice receptorových tyrozinkináz (RTK) RTK představují klíčové receptorové struktury extracelulárních mitogenních signálů (růstových faktorů) Monoklonální protilátky jsou zacílené na extracelulární receptorovou část RTK. Nízkomolekulární tyrozinkinázové Inhibitory (TKI) blokují intracelulární tyrozinkinázovou doménu RTK. Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 19 © Ondřej Slabý, 2009 Cílená léčba: terapie cílená na nádorové buňky – inhibice proliferace Klener, 2010 Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 21 © Ondřej Slabý, 2009 Cílená léčba: terapie cílená na nádorové buňky – inhibice proliferace Klener, 2010 Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 22 © Ondřej Slabý, 2009 Receptorová rodina ErbB a nádorová onemocnění ErbB jsou receptory typu 1 tyrozinkinázové rodiny, představují 4 transmembránové glykoproteiny ErbB1 -ErbB4 (HER1 -HER4) Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 23 © Ondřej Slabý, 2009 Cross-talk s dalšími onkogenními signálními drahami Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 24 © Ondřej Slabý, 2009 Receptorová rodina ErbB a nádorová onemocnění Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 25 Cílená léčba: terapie cílená na nádorové buňky – inhibice proliferace Úvod do molekulární medicíny 8/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 26 Duální inhibice kináz Úvod do molekulární medicíny 8/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 27 © Ondřej Slabý, 2009 Cílená léčba: terapie cílená na nádorové buňky – inhibice proliferace Klener, 2010 Strana 28 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 8/12 Cílená léčba: terapie cílená na nádorové buňky – inhibice angiogeneze Klener, 2010 Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 29 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 30 © Ondřej Slabý, 2009 Cílená léčba: antiresorpční léčba kostních metastáz mAB proti RANKL osteoprotegerin Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 32 © Ondřej Slabý, 2009 Test for drug response* 60% benefit from therapy 86% benefit from therapy Try alternate therapy High response to therapy Low response to therapy A/A C/C A/C Treat TEST Don’t Treat? * Specific blood, tissue or imaging marker that can be used to prospectively identify patients for efficacy, safety and/or dose Cílená léčba: prediktivní onkologie: individualizace léčby Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 31 © Ondřej Slabý, 2009 Cílená léčba: prediktivní onkologie: individualizace léčby Results: K-Ras Mutation and OVERALL RESPONSE RATE CETUXIMAB PANITUMUMAB mAb proti EGFR Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 33 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 34 © Ondřej Slabý, 2009 Moderní transportní systémy léčiv: lipozomy a nanočástice Ideální nano- transportní systém zajistí, že konjugát léčiva a transportního systému doručí léčivo do specifického místa účinku. Lipozomy a nanočástice jsou účinné technologie pro racionální transport cytostatik v terapii nádorových onemocnění. Jejich užití zlepšuje farmakokinetické vlastnosti, kontrolované a prodloužené Uvolňování léčiva a především nižší systémovou toxicitu. Do praxe zaveden lipozomalní Doxil (doxorubicine), nanočásticový na albumin vázaný Paclitaxel – nab Abraxane Lipozomy jsou to částice tvořené fosfolipidy o velikosti 0,6–2 μm s tloušťkou membrány 5 nm. Jádro i povrch lipozomu je hydrofilní, vnitřek membrány tvoří lipofilní zbytky mastných kyselin fosfolipidů. Léčivo je možné umístit podle jeho povahy do jádra nebo do membrány lipozomu Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 35 © Ondřej Slabý, 2009 Moderní transportní systémy léčiv: lipozomy a nanočástice Úpravou povrchu lipozomů, např. polyethylenglykolem (PEG), se prodloužila jejich cirkulace v krevní plazmě a částečně se vyřešil problém s jejich vychytáváním jako cizorodých částic retikuloendoteliárním systémem. V praxi se používají léky s obsahem daunorubicinu a doxorubicinu jako parenteralia ve farmakoterapii Kaposiho sarkomu, s amfotericinem B při léčbě invazivních plísňových infekcí, s obsahem virionů inaktivované hepatitidy A jako očkovačí látka proti hepatitidě A, při terapii syndromu dechové nedostatečnosti u předčasně narozených dětí s obsahem lyofilizátu z hovězích plic, s ekonazolem při lokálním ošetření plísňových kožních chorob. Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 36 © Ondřej Slabý, 2009 Lipozomy: aktivní a pasivní transport Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 37 © Ondřej Slabý, 2009 Nanočástice V současnosti je největší pozornost věnována nanočásticím. Svou velikostí 60–300 nm leží nanočástice na subcelulární úrovni a mohou se proto jako lékové mininosiče cíleně usměrnit do orgánů, tkání, buněk a nemocných částí těla, které zůstávají jiným lékovým formám nedostupné. Jsou určeny pro cílené uvolňování a působení léčiva při perorálním, parenterálním i lokálním podání, pro aplikaci do oka i nosu. Volbou metody přípravy a aktivizací povrchu nanočástic je možné je nasměrovat na různé cíle. Očekává se od nich využití při cíleném transportu cytostatik, specifickém doručení antibiotik a antiparazitik, v perorálních lékových transportních systémech pro inzulin, proteiny, geny, pro vakciny i při topické aplikaci. Solid lipids nanočástice Polymerové nanočástice PLA - polyactid PLGA - poly(D,L-lactide–co-glycolide) PEG - polyethylenglykol Zlaté nanočástice Albuminové nanočástice Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 38 © Ondřej Slabý, 2009 Nanočástice Syntéza zlaté nanočástice Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 39 © Ondřej Slabý, 2009 Nanočástice Malam et al., Trends in Pharmacological Sciences, 2009 Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 40 © Ondřej Slabý, 2009 Albuminové nanočástice Abraxane je první léčivo založené na nanočásticovém transportu vazbou na albumin (nab). nab Paklitaxel má proti volnému paklitaxelu delší poločas a proti rozpozštědlu Cremophor EL, ve kterém je paklitaxel podáván nezpůsobuje hypersenzitivitu. Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 41 © Ondřej Slabý, 2009 Genová terapie • většina chorob člověka je způsobena genetickou predispozicí spojenou s environmentálními vlivy. (nature and nurture) • terapie zpravidla pouze modifikuje symptomy nemoci, či dává tělu možnost se uzdravit samo • genová terapie: efektivní a kauzální léčba by změnila samotnou genetickou podstatu nemoci, nikoli jenom symptomy • Pokud by se zdařila excize „špatné“ alely a její nahrazení „správnou“, otevřely by se dveře pro „genetickou chirurgii“ • Obavy z „genetického dopingu“ již i na OH v Turíně • Otázky „plastické genetiky“ gene trials phases Somatic-cell gene therapy (= změna genetické informace pouze u somatických buněk) Germ-line gene therapy Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 42 © Ondřej Slabý, 2009 In vivo a ex vivo genová terapie Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 43 © Ondřej Slabý, 2009 Ex vivo genová terapie Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 44 © Ondřej Slabý, 2009 20-16-GeneTherapy-L Ex vivo genová terapie Úvod do molekulární medicíny 8/12 Strana 45 © Ondřej Slabý, 2009 Životní cyklus retroviru vektor kapa-cita snadnost produkce integrace do genomu trvání exprese transdukce nedělících se buněk existující imunita bezpečnost přenos do potomstva nevirální bez limitu +++ zřídka dočasná ++ ne +++ ne onko-retroviry 8 kb ++ ano stabilní - ne inserční mutagenese aktivace onkogenů může lentiviry 8 kb + ano stabilní ++ ne inserční mutagenese aktivace onkogenů může adenoviry 30 kb + ne dočasná +++ ano hyperimunitní odpověď ne adeno asociated virus AAV 4.6 kb + možná dlouho-trvající ++ slabá +++ může Herpes viry 150 kb + ne dočasná ++ ano hyperimunitní odpověď ne metody doručení genu do tkáně Genová terapie První úspěšná genová terapie byla provedena 24. září 1990 v NIH v Marylandu ADA •čtyřleté děvčátko trpělo nemocí zvanou ADA (adenozin deaminázová deficience) „bublinové děti“ • při léčbě do ní byly vloženy její vlastní buňky imunitního systému (zejména T-lymfocyty), které byly upraveny tak, že do nich byla ex vivo vložena normální kopie ADA genu •několik týdnů po té, co genová terapie začala, došlo k zlepšení práce imunitního systému a po několika měsících začala pacientka žít „relativně normální život“ genetherapy7 První evidentní úspěchy genové terapie: X-SCID §případ z roku 1990 získal mnoho publicity §později bylo opakováno s dalšími pacienty (na jednoho pacienta 10 – 12 treatments) úu některých z nich došlo k dramatickému zlepšení úvšichni pacienti ale byli zároveň léčeni enzymovými preparáty, takže není jisté, co stojí za tímto úspěchem §první jednoznačný a jasný úspěch genové terapie se projevil na příbuzné nemoci, na X-linked SCID §opět šlo o léčbu ex vivo §byl užit retrovirus ve kterém byl obsažen gen IL2R, který kóduje γc cytokinový receptor §kmenové buňky kostní dřeně, exprimující CD34 (=což dělají pouze hematopoietické buňky kostní dřeně) byly inkubovány 3 dny v přítomnosti retrovirového vektoru úběhem tohoto času se buňky rozdělily 5-8x §tyto buňky byly později vráceny do pacientů §u 9 z 11 pacientů došlo k pronikavému zlepšení a tito pacienti mohli vést normální život !!!!! U dvou z těchto vyléčených chlapců došlo později k vzniku leukémie, skoro jistě díky aktivaci LMO2 onkogenu tento onkogen se aktivoval tím, že do jeho blízkosti se inzertoval retrovirus díky tomuto faktu byly pokusy s retrovirální transdukcí lymfocytů pozastaveny Jesse Gelsinger §narozen 18/06 1981 §první příznaky nemoci 2 roky a osm měsíců úeratické chování, po dietě bohaté na proteiny, následuje prudké zhoršení stavu, upadá do komatu §diagnostikován OTC (ornithine transcarbamylase deficiency syndrome), vzácná metabolická choroba – 50 % dětí s touto chorobou umírá do 1 měsíce po porodu úJG má nemoc ovšem pouze v mírné formě, léčitelné medikamenty a dietou úpokud je potrava bohatší na proteiny, úv krvi se objevuje množství amoniaku §v roce 1990 bere JG padesát §pilulek denně ureacycl human_2 §čeká na den svých 18. narozenin, aby mohl poskytnout informovaný souhlas s léčbou §13. září 1999 dostává genovou terapii, večer je mu špatně, další den odpoledne upadá do kómatu §17. září 1999 umírá §smrt nastává evidentně a jasně následkem terapie §případ vyvolal zděšení mezi vědeckou komunitou a zaplnil přední stránky novin §celá kauza rozvířila řadu otázek ohledně kvality informovaného souhlasu úřada důležitých informací totiž podléhala různým obchodním tajemstvím. Paul Gelsinger (otec) nyní obviňuje nemocnici ze zamlčení důležitých informací a z úmyslného riskování života jeho syna Jesse Gelsinger C:\Users\Marek\Desktop\Pictures\2008-08-15\001.jpg Strategie genové terapie C:\Users\Marek\Desktop\Pictures\2008-08-15\001.jpg Strategie genové terapie principy genové terapie rakoviny nrc1101-130a-f2 nrc1101-130a-f2 doručení konstruktu zajišťující zastavení exprese onkogenu (antisense konstrukt) doručení nemutovaného supresorového genu p53 využití onkoretrovirálních vektorů doručení sebevražedného genu přeměňující pro-drug na toxin nrc1101-130a-f3 principy genové terapie nádorů principy genové terapie nádorů transdukce virovým vektorem obsahujícím gen pro thymidinkinázu viru herpes simplex lze dosáhnout zvýšení senzitivity nádorových buněk např. ke gancykloviru) principy genové terapie nádorů nrc1101-130a-f4 •nádorové buňky jsou cíleně ničeny lytickými viry •1956 bylo pozorováno že nádor ustupuje po virové infekci •první klinicky testovaný virus byl defektní herpesvirus G207, který měl defektní vlastní ribonukleotid reduktázu a mohl se tudíž replikovat pouze v dělících se buňkách, měl deleci vgenu způsobující virulenci ICP35.4 a tím byl oslaben a proto bezpečný •proběhla I a II fáze klinického testování ONKOLYTICKÉ VIRY Preimplantační genetická diagnostika Při riziku genetické vady je možno se pokusit o zjištění, zda zárodek vzniklý technikou asistované reprodukce (ART má žádoucí – nerizikovou- kombinaci genů ještě před přenosem do dělohy. I když PGD nemůže zcela nahradit genetické vyšetření plodu v pozdějších stadiích těhotenství, významně sníží riziko genetického postižení plodu. Umožňuje genetickým vyšetřením 1 - 2 buněk (blastomer) odebraných z vyvíjejícího se embrya odhalit specifické genetické abnormality budoucího plodu. VÁNOCE!!!!!!! HEZKÉ SVÁTKY!!! Náplň příští přednášky Take home Strana 47 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 8/12 Fáze klinického hodnocení léčiv Randomizace, zaslepení, interim analýza, metanalýzy Monoklonální protilátky - typy Příprava monoklonálních protilátek Biologické účinky monoklonálních protilátek Cílená léčba protinádorových onemocnění: obecná strategie Cílená léčba protinádorových onemocnění: inhibice RTK Cílená léčba protinádorových onemocnění: inhibice angiogenze Cílená léčba protinádorových onemocnění: léčba kostních metastáz Individualizace léčby: příklad anti-EGFR terapie Moderní transportní systémy Moderní transportní systémy-lipozomy Moderní transportní systémy-nanočástice Genová terapie – definice, obecné strategie Ex vivo a in vivo genová terapie Metody doručení genu do tká ně Příklady genová terapie u monogenních dědičných chorod ADA, X-SCID Principy genové terapie nádorových onemocnění Preimplantační genetická diagnostika Strana 37 © Ondřej Slabý, 2009 Dotazy? Úvod do molekulární medicíny 8/12