Stanovení obsahu inosinu, adenosinu a jejich 2´-deoxy- forem
v modelové směsi – optimalizace a validace metody
Úloha do laboratorního cvičení - Speciální metody
pro magisterské studium Ústav chemie-Analytická chemie, podzimní semestr
Pro základy kapalinové chromatografie na reverzní fázi (RPLC) prostudujte také
návod k úloze do laboratorního cvičení Metody chemického výzkumu v jarním semestru.
Znalost těchto informací bude v rámci úlohy ověřena.
1 Cíl úlohy
I. modelová optimalizace HPLC metody s využitím plánu pokusů
a umělých neuronových sítí
II. validace optimalizované HPLC metody
2 Teorie
2.1 Optimalizace metody
Při vývoji nové HPLC metody je důležité docílit separace všech sledovaných látek
a to za co nejkratší dobu. Separace i celková délka analýzy je ovlivněna mnoha faktory
(složení mobilní fáze, pH, teplota, průtoková rychlost, povaha vzorku). Proces hledání
nejlepších separačních podmínek pro vybraný analyt/skupinu analytů se nazývá optimalizace.
Optimalizace je založena na znalosti použitého systému a povahy analytu. Na základě těchto
znalostí je možné navrhnout vhodné parametry k optimalizaci. Nejdůležitější parametry jsou
diskutovány v návodu pro podzimní úlohu, kapitola 2.4.
Při optimalizaci lze postupovat „klasickým způsobem“, kdy se při konstantních
podmínkách změní úroveň vždy jen jedné optimalizované veličiny (např. pH vodné složky
mobilní fáze). Tento postup vyžaduje velké množství experimentů, z čehož plyne jak časová
tak materiálová náročnost. Plánování pokusů (experimental design, ED) snižuje počet nutných
experimentů cílenou změnou více parametrů zároveň. Experimentátor nejdříve zvolí okrajové
hodnoty optimalizovaných faktorů (např. pH by mělo být optimalizováno od 3 do 7, procento
organické složky od 0 do 40 %). Plán pokusů pak již určí experimenty, které je nutné provést,
abychom pokryly celou optimalizovanou oblast všech faktorů. Mezi častý typ plánu pokusů
patří faktorový plán, hvězdicový plán a jejich kombinace – centrálně kompozitní plán (central
composite design, CCD).
- 1 -
Předností faktorového plánu (factorial design) je možnost odhalení vzájemné
interakce jednotlivých proměnných (pokud existují). Počtu vstupních proměnných odpovídá
počet rozměrů (optimalizovaných faktorů, např. pH vodného roztoku; f). Počtu hodnot každé
vstupní proměnné odpovídá počet úrovní (hladin, na kterých je faktor měřen, např. pH 3, 5 a 7
při optimalizaci pH vodné složky; L) – viz. Obr. 1. Celkový počet bodů (experimentů) je
přitom dán vztahem: n = Lf
.
A B
Obr. 1 Schéma faktorového plánu pro případ optimalizace dvou (např. pH vodné složky
a obsah metanolu v mobilní fázi; A) a tří faktorů (např. pH vodné složky,
koncentrace solí a obsah metanolu v mobilní fázi; B). Černé body odpovídají
podmínkám jednotlivých experimentů.
Hvězdicový plán (star design) je vhodný pro vyjádření hyperplochy a obsahuje
(2f+1) bodů (Obr. 2).
A B
Obr. 2 Schéma hvězdicového plánu pro dva (A) a tři (B) optimalizované faktory.
- 2 -
A B
Obr. 3 Schéma centrálně kompozitního plánu (CCD) pro dva (A) a pro tři (B) rozměry
(optimalizované faktory).
Kombinací faktorového a hvězdicového plánu získáme centrálně kompozitní plán
(central composite design, CCD; Obr. 3). Počet bodů odpovídá 2f
+ 2f +1 (Obr. 4A). Body
z faktorového plánu (na Obr. 4A zobrazeny žlutě) mají jednotkovou vzdálenost od centrálního
bodu (na Obr. 4A vyznačen červeně). Body hvězdicového plánu (na Obr. 4A označené
zeleně) mají vzdálenost α, kdy α > 1 a závisí na počtu faktorů. α lze vypočítat podle vzorce:
α = 2f/4
.
Existují tři typy CCD designu (Obr. 4B). Rozdíl mezi nimi je v interpretaci krajních
hodnot optimalizovaných faktorů zadaných operátorem (viz. výše). Výše byl uveden příklad
krajních hodnot pro optimalizaci pH vodné složky od 3 do 7. Tyto limity byly zvoleny podle
pH stability stacionární fáze a proto není možné jejich překročení. U typu CCD I však design
záměrně krajní hodnoty překračuje, aby lépe zmapoval chování systému ve zvolených
intervalech. Proto CCD I není možné aplikovat v případech, kdy operátorem zvolené intervaly
jednotlivých faktorů jsou limity reálnými (např. obsah organické složky 0 %). V takových
případech volíme jeden z alternativních typů CCD. V případě CCD II dělíme body
hvězdicového designu (Obr. 4B, růžové body) hodnotou α. V případě CCD III dělíme
všechny body vyjma centrálního hodnotou α. Tím docílíme „zmenšení“ plánu pokusů tak, že
pokrývá námi zadané limity.
- 3 -
Pro vyhodnocení dat získaných z experimentů podle plánu pokusů je výhodné
použít umělých neuronových sítí. Výsledkem je aproximace hyperplochy napříč celým
intervalem všech optimalizovaných faktorů, ze které lze získat optimální separační podmínky.
1
-1
CCD I CCD II CCD III
A B
Obr. 4 A – Vyznačení vzdáleností bodů faktorového designu (žluté body) a hvězdicového
designu (zelené body) od centrálního bodu (červený bod). B – Tři typy CCD
designu. „1“ a „-1“ označují vzdálenost od centrálního bodu designu a operátorem
zadané hranice pro jeden z optimalizovaných faktorů.
2.2 Umělé neuronové sítě
Umělé neuronové sítě (artificial neural networks, ANNs) byly vytvořeny na základě
jednoduchých modelů neuronů – funkčních buněk nervového systému živých organismů.
Každá neuronová síť převádí (transformuje) hodnoty vstupních veličin na hodnoty výstupních
veličin pomocí transformační funkce. ANN lze využít při modelování a řízení složitých
soustav, které nelze s uspokojivou přesností matematicky popsat, nebo matematický model
procesu je tak složitý, že jeho případná algoritmizace je buď časově a programově velmi
náročná nebo dokonce nemožná.
2.2.1 Popis a matematický model umělé neuronové sítě
ANN je tvořena neurony nejčastěji uspořádanými do vrstev. Každý neuron přijímá
signály z neuronů předchozí vrstvy nebo z vnějšího zdroje (Obr. 5). Význam každého z těchto
vstupů je určen vahou vstupu wij, kde dochází k tlumení nebo buzení signálu. Vstupní hodnota
(xj) neuronu j je tedy dána součtem výstupů z neuronů i (yi) vynásobených vahami spojení
mezi neurony i a j (wij):
Aplikací aktivační funkce je vstupní hodnota xj přeměněna na hodnotu výstupní yj:
- 4 -
Tímto je korigována amplituda výstupu neuronu do akceptovatelného rozmezí. To je obvykle
definováno jako interval (-1;1), nebo (0;1). Výstup je buď konečným výsledkem, nebo je
předán neuronům v dalších vrstvách.
Obr. 5 Matematický model neuronu. Výstup z neuronů na i-té úrovni je na základě vah
Vrstvy tvořené neurony lze rozdělit podle jejich umístění na 3 části. První vrstva se
nazývá vs
∑
výstup na
i-té úrovni
...
...
y1
y2
y3
y4
yn
synaptické
váhy
aktivační
funkce
sumační
funkce
výstup na
j-té úrovni
xj
vstup z
j-té úrovně
yjφ∑
výstup na
i-té úrovni
...
...
y1
y2
y3
y4
yn
synaptické
váhy
aktivační
funkce
sumační
funkce
výstup na
j-té úrovni
xj
vstup z
j-té úrovně
yjφ
spojení sečten. Suma je dále zpracována aktivační funkcí, která reguluje amplitudu
výstupu do akceptovatelné meze (většinou (-1;1), nebo (0;1))
tupní a má za úkol přijímat hodnoty z okolí pro zpracování a přivést je na vstup
každého neuronu následující vrstvy. Druhá vrstva je označována jako skrytá. Počet skrytých
vrstev ve vnitřní části závisí na složitosti funkce, kterou má síť vykonat a na zvoleném typu
sítě. Ve většině případů je dostatečná jediná skrytá vrstva. Úkolem skrytých vrstev je zvýšení
aproximačních vlastností neuronové sítě. Poslední vrstva, výstupní, obsahuje neurony
předávající signál do okolí. Tyto výstupní signály jsou pak odezvou neuronové sítě na signály
vstupní.
- 5 -
Obr. 6 Model neuronové sítě s jednou skrytou vrstvou. Jako vstupní vrstva jsou použity
např. hodnoty optimalizovaných faktorů naplánované dle plánu pokusů (např. pH,
koncentrace solí, obsah organické složky). Dva neurony výstupní vrstvy jsou pak
např. retenční časy dvou analytů pozorované za podmínek definovaných pomocí
vstupních neuronů.
Podle toku signálu neuronovou sítí pak dělíme sítě na dopředné (feed-forward) a se
zpětnou vazbou (rekurentní, feed-back). Při použití struktury s dopředným šířením signálu se
signál šíří po orientovaných spojnicích jenom jedním směrem. V rekurentních sítích existují
mezi neurony nebo vrstvami zpětné vazby.
2.2.2 Trénování umělých neuronových sítí
Základní a velmi podstatnou vlastností ANN je schopnost učit se. Fáze učení
předchází fázi vlastní práce a slouží k určení se váhových koeficientům mezi neurony. Fáze
učení může probíhat dvěma způsoby, s učitelem a bez učitele. Při metodě učení s učitelem je
síť trénovaná pomocí dvojice vstupní vzorek a příslušný, očekávaný výstupní vzorek.
Využívají se trénovací data v takovém rozsahu, aby plně popsaly všechny vlastnosti množiny
důležité pro danou úlohu. V našem případě se jedná o výsledky z experimentů naplánovaných
s pomocí plánu pokusů. Jako vstupní vzorek vezmeme složení mobilní fáze a výstupním
vzorkem je některý z parametrů separace, např. rozlišení mezi dvěma sousedními analyty,
retenční čas poslední látky atd. Na základě skutečné odezvy trénované sítě a očekávané
odezvy se upravují váhové koeficienty. U metody učení bez učitele systém nedostává
očekávané výstupy od učitele, ale odvozuje si je od svého výstupu prostřednictvím zpětné
vazby.
- 6 -
K trénování sítě existuje několik trénovacích algoritmů. Algoritmus učení dopředné
neuronové sítě metodou zpětného šíření chyby (Backpropagation Algorithm) je nejčastější
používaná metoda. Základem je vrstvená síť, kde nejsou žádné zpětné vazby. Chyba se šíří
zpětně přes všechny vrstvy k první vrstvě. Musí ale být známa vstupní a výstupní dvojice
hodnot.
Během procesů učení je nutno dávat pozor na tzv. přetrénování sítě (popsáno níže).
Přetrénovaná síť dává sice přesné výsledky pro trénovací data, ale nerelevantní výsledky pro
data, se kterými se doposud nesetkala. Ztrácí tzv. vlastnost zobecnění. Pro zabránění
přetrénování sítě se data před trénováním rozdělují na 3 (případně pouze 2) části: data
trénovací, data validační (tato data nejsou nutná) a testovací data. Trénovací data se využívají
pro nastavení vah sítě a musí pokrývat celý interval optimalizovaných parametrů. Tato data
získáme např. z experimentů provedených na základě plánu pokusů, který tyto předpoklady
naplňuje. Pro nejvhodnější nastavení parametrů (např. počet skrytých vrstev, počet neuronů
ve skryté vrstvě) se využívají validační data, která mohou být součástí dat trénovacích.
Testovacími daty se ověří funkce natrénované ANN. Jde o data náhodně vybraná v celém
intervalu testovaných parametrů, která nejsou součástí trénovací sady.
2.2.3 Kontrola učení umělých neuronových sítí
Míra úspěšnosti natrénované ANN lze hodnotit podle střední kvadratické chyby
(RMS, root mean square error), která se vypočte podle vzorce:
,
kde h je počet vzorků (počet řádků), m je počet výstupních proměnných, o je vypočítaná
hodnota j-tého neuronu pro i-tou proměnnou, t je očekávaná (experimentálně zjištěná)
hodnota j-tého neuronu pro i-tou proměnnou. Umocněním na druhou RMS zvyšuje váhu
větších rozdílů. Pokud máme pouze jednu výstupní proměnnou, vzorec se zjednoduší na:
.
RMS je většinou automaticky počítána během trénování sítě pro trénovací
i testovací sadu. Díky učení ANN na trénovacích datech se chyba pro tato data s počtem
- 7 -
učících cyklů snižuje. Při trénování sítě jde ve většině případů o její schopnost generalizovat.
Kritériem úspěšnosti sítě v tomto ohledu je RMS u testovacích dat. Tato chyba nejdříve klesá,
ale po určitém počtu cyklů začne znovu růst (Obr. 7). V takovém případě již hovoříme
o přetrénování sítě – síť je schopná přesně předpovědět výstupní neurony pro trénovací data,
ale ztrácí již schopnost generalizovat problém na data, se kterými se ještě nesetkala. Učení
sítě se proto zastavuje v místě, kde je pozorována nejnižší chyba v předpovědi pro testovací
data.
učící cykly
chyba
testovací chyba
trénovací chyba
zastavení učení
oblast přetrénováníoblast trénování
Obr. 7 Průběh chyby předpovědi v průběhu učících cyklů pro trénovací a testovací data.
Červená čára označuje počet učících cyklů, kde je pozorována minimální chyba
předpovědi pro testovací data. V tomto bodě se zastavuje trénování sítě. Při více
učících cyklech se chyba pro testovací sadu zvětšuje a dostáváme se do oblasti
přetrénování sítě.
Důležitým kritériem není jen průměrná odchylka, ale také rozptyl chyb. Průměrná
absolutní chyba (MAE, mean absolute error) udává průměrnou hodnotu absolutních rozdílů
mezi předpovězeným a naměřeným údajem:
,
kde h je počet vzorků (počet řádků), o je vypočítaná hodnota j-tého neuronu, t je očekávaná
(experimentálně zjištěná) hodnota j-tého neuronu (obdobně platí i pro sítě s více výstupními
neurony). V případě RMS jsou odchylky před zprůměrováním umocněny a větší odchylky tak
mají větší váhu. U MAE jsou si všechny odchylky rovnocenné (průměrují se rovnou bez
- 8 -
umocnění). RMS nabývá stejné nebo větší hodnoty než MAE. Pokud RMS = MAE, pak
všechny odchylky mají stejnou velikost. Čím větší rozdíl mezi RMS a MAE, tím větší je
rozdílnost mezi odchylkami.
Linearitu vztahu mezi předpovězeným a pozorovaným retenčním časem lze
hodnotit korelačním koeficientem (r).
2.2.4 Využití natrénované umělé neuronové sítě
Natrénovanou ANN lze využít k předpovědi výstupních neuronů pro všechny
možné kombinace vstupních neuronů. Jediným limitem je rozsah hodnot jednotlivých
vstupních neuronů, který se musí řídit rozsahem použitým pro trénování sítě. Stejně jako
u kalibrací, tak i u ANN není možné výsledky extrapolovat. Grafickou závislost hodnoty
výstupního neuronu na hodnotě vstupních neuronů nazýváme hyperplochou (Obr. 8).
Hyperplochu, případně dvojice vstupních a výstupních dat, je možné využít k nalezení
optimálních podmínek separace.
Při hledání optimálních podmínek je vhodné řídit se obecnými doporučeními pro
metody kapalinové chromatografie. Těmi základními jsou: 1) rozlišení mezi sousedními
analyty alespoň musí být alespoň 1,5 a 2) doba analýzy by měla být co nejkratší. Doporučuje
se také, aby retenční čas analytu byl větší než dvojnásobek mrtvého retenčního času.
U monolitických kolon je však separace rychlejší v porovnání s částicovými kolonami. Proto
tento předpoklad nebývá v některých případech splněn. Předpoklady pro HPLC metodu do
určité míry naznačují výhodnost zvolení rozlišení sousedních analytů a retenčního času
poslední látky jako výstupní neurony při trénování ANN. U složitějších směsí je v některých
příkladech zapotřebí počet výstupních neuronů minimalizovat. Platí totiž, že čím více
výstupních neuronů, tím méně správné jsou výstupy ANN.
Několik vybraných mobilních fází se nakonec ověřuje experimentálně. Chyby
experimentálních výsledků od předpovězených jsou běžně do 30 %. V průměru bývají chyby
okolo 10 %. V případě, že chyby jsou větší, je nutné zvážit volbu jiné topologie sítě (více, či
méně vnitřních neuronů, více vrstev) včetně zahrnutí dalších vstupních veličin nebo naopak
odebrání některého z výstupních neuronů.
2.3 Validace metody
Protože způsob získávání a zpracování experimentálních dat ovlivňuje konečné
výsledky z hlediska přesnosti a správnosti, je nutné ověřit funkčnost zvoleného analytického
- 9 -
postupu. Před zavedením analytické metody do praxe je proto nutné zjistit vhodnost metody
pro řešení daného analytického problému, statisticky prokázat spolehlivost (tj. přesnost
a správnost metody) analytické metody včetně celého obslužného analytického systému
a vyšetřit její praktické hranice použitelnosti. Tento proces se nazývá validace metody.
Validace se používá nejen po vyvinutí nové analytické metody, ale také při převodu
analytické metody z jiné laboratoře.
2.3.1 Druhy validací
Validace metody v rámci jedné laboratoře se nazývá interní (vnitřní) validace a lze
ji dále rozdělit:
1. průzkumová validace se stanovuje na omezeném počtu vzorků a slouží ke
zjištění vhodnosti analytické metody pro daný úkol
2. plná validace obsahuje vyhodnocení všech validačních parametrů
3. validace při převodu metody slouží pro zavedení již validované metody
z jiné laboratoře
4. retrospektivní validaci lze využít pro již dříve naměřená data
Externí (vnější) validace zahrnuje interní validaci společně s validací metody
srovnáním výsledků metody z více laboratoří a zahrnuje ověření reprodukovatelnosti metody.
Cílem validace metody je zjistit selektivitu, správnost, přesnost (opakovatelnost,
dlouhodobá opakovatelnost), selektivitu, linearitu, dynamický rozsah, limit detekce, limit
kvantifikace a robustnost.
2.3.2 Test způsobilosti HPLC
Pokud zvolíme za analytickou metodu HPLC je nutné před zahájením vývoje nové
metody, před validací metody i v průběhu studie provádět test způsobilosti HPLC. Tímto
testem ověřujeme schopnost HPLC systému dávat relevantní, správné a přesné výsledky. Test
zahrnuje:
1. Test opakovaného nástřiku (6 nástřiků, relativní směrodatná odchylka –
RSD by měla být menší než 1,5 %)
2. Test linearity (zvolit si min. 5 bodů o různé koncentraci, koeficient
determinace by neměl dosahovat menší hodnoty než 0,9900)
3. Test účinnosti chromatografické separace
- 10 -
2.3.3 Validační parametry
2.3.3.1 Selektivita
Selektivita analytické metody je schopnost přesného a správného určení analytu
i v přítomnosti interferujících látek (matrice). Neselektivní metoda dává signál, který
neodpovídá skutečnému obsahu analytu, ale je zesílen signálem rušivé složky. Pokud je
k dispozici matrice vzorku, analyzujeme matrici, dále vzorek bez matrice i bez analytu
(v případě HPLC nastříkneme mobilní fázi), standardní roztoky sledovaných látek, kontrolní
vzorky (matrice + standardy stanovované složky), vzorky s přídavkem standardní
(stanovované) složky. Zjistíme, zda interference pochází ze srovnávacího vzorku metody, pak
se musí odstranit zdroj interference (kontaminace rozpouštědla, laboratorního nádobí,
přístrojů atd.) nebo pochází ze srovnávacího vzorku matrice a je nutné optimalizovat extrakci
vzorku, předseparaci (čištění vzorku). Odezva interferujícíchh látek musí být menší než 1%
odezvy nejnižší koncentrační hladiny analytu ve vzorku.
2.3.3.2 Přesnost (Precision)
Přesnost analytické metody je míra shody mezi jednotlivými výsledky získanými
z několika měření stejných homogenních vzorků za daných podmínek. Přesnost se vyjadřuje
na 3 úrovních. opakovatelnost, dlouhodobá opakovatelnost a reprodukovatelnost.
1. Opakovatelnost (Repeatability) se zkoumá na identickém materiálu (měří
se 3-5 vzorků na několika koncentračních hladinách) použitím téže
zkušební metody, v téže laboratoři, stejným pracovníkem za použití týchž
přístrojů a zařízení, během krátkého časového rozmezí.
2. V dlouhodobé opakovatelnosti (Intermediate Precision) se promítá
variabilita v měření. Nejčastěji měřením v delším časovém okamžiku,
provedení jiným pracovníkem nebo s jiným laboratorním vybavením.
3. Reprodukovatelnost (Reproducibility) vyjadřuje míru shody mezi
jednotlivými laboratořemi a je potřebná při přenosu analytické metody
z laboratoře, kde je používaná, do jiné laboratoře.
2.3.3.3 Správnost (Accuracy)
Správnost je definovaná jako odchylka od správné hodnoty. Vyjadřuje se jako
výtěžnost (Recovery) a udává poměr množství analytu zjištěného danou analytickou metodou
k přidanému množství. Udává se jako desetinný zlomek nebo v procentech. V HPLC se
- 11 -
vyhodnocuje analýzou vzorku s přidaným standardem na minimálně třech koncentračních
hladinách v co nejširším kalibračním rozsahu. Počet paralelních opakování by se měla
pohybovat kolem 7 a relativní směrodatná odchylka pro každou koncentrační hladinu nemá
být větší než 3%. Výtěžnost (100×zjištěno/přidáno) pro koncentrační hladinu se má
pohybovat v rozmezí 95% až 105%.
2.3.3.4 Linearita (Linearity)
Linearita vyjadřuje schopnost
metody dávat v daném rozsahu
koncentrací výsledky přímo úměrné
koncentraci stanovované látky ve
vzorku. Pro určení linearity se volí
minimálně 5 vzorků v celé měřící
oblasti. Provede se regresní analýza
(zjištění regresních koeficientů a a b
včetně testování jejich statistické
významnosti, zjištění korelačního
koeficientu – r a koeficientu determinace
– r2
). Ke statistickému potvrzení
linearity sledované závislosti je možné
využít např. tabulky kritických hodnot korelačních koeficientů r pro lineární závislost – viz.
Tab. 1. Přesnost kalibrační přímky představuje interval spolehlivosti. Ten je nejužší ve středu
kalibrace, a proto je vhodné konstruovat kalibrační přímky s ohledem na tuto skutečnost tak,
aby očekávané hodnoty měřené veličiny leželi přibližně uprostřed voleného kalibračního
rozsahu. Z obrázku 8 je také patrná nutnost co možná nejpřesnějšího určení y i x při
kalibračních experimentech. Za podmínek zobrazených na Obr. 8 (velikost intervalu
spoelhlivosti kalibrační přímky a měřeného signálu y) nám totiž vychází interval spolehlivosti
zjišťované koncentrace přes téměř celý kalibrovaný interval! Výpočet intervalu spolehlivosti
kalibrace není triviálním úkonem, zvládá jej však většina statistických programů, včetně
programu Statistica.
Obr. 8 Určení intervalu spolehlivosti
[LD,LH] koncentrace c na základě
intervalu spolehlivosti signálu
y [UD,UH].
Tab. 1: Kritické hodnoty korelačního koeficientu r pro počet stupňů volnosti ν a dvě
hladiny významnosti α pro který platí ν = n – 2, kde n představuje počet
korelačních bodů
- 12 -
α α α
ν
0,05 0,01
ν
0,05 0,01
ν
0,05 0,01
1 0,999 999 6 707 834 11 553 684
2 0,950 999 7 666 798 12 532 661
3 0,878 959 8 632 765 13 514 641
4 0,811 917 9 602 735 14 497 623
5 754 875 10 576 708 15 482 606
2.3.3.5 Limit detekce (Detection Limit)
Existuje jak horní tak dolní limit detekce. Dolní limit detekce (LOD) je nejnižší
množství analytu ve vzorku, který ještě může být detekován. Existuje několik možností jak ho
stanovit. U separačních metod lze využít hodnoty signálu slepého pokusu a kalibrační přímky.
Z chromatogramu slepého pokusu se určí maximální kolísání základní linie (hmax) v oblasti
dané 20-ti násobkem pološířky píku stanovovaného analytu. Pro odezvu detekovatelného
množství analytu pak platí: yd = 3 × hmax a pro koncentraci na mezi detekce: xd = yd/b1, kde
směrnice kalibrační přímky b1 musí být z koncentrační závislosti y = b1x, kde y je výška
chromatografického píku a ne plocha.
Další možností je metoda postupného zřeďování, kdy dávkovaný analyt postupně
ředíme až do okamžiku, kdy poskytnutý signál má ještě výšku 3× větší než průměrný šum.
Početně lze tento problém řešit z informací dostupných v chromatogramu, kde koncentrace
analytu je natolik nízká, že je viditelný i šum základní linie. K výpočtu LOD pak využijeme
např. vzorce:
S
cN
LOD
..3
= ,
kde S je výška signálu analytu při koncentraci analytu c a N je výška šumu základní linie. Jak
je z vysvětlení patrné, existují odlišnosti v možných přístupech. Vždy je proto nutné vedle
hodnoty LOD či jiných limitů metody, uvést také způsob, jakým bylo výsledků dosaženo.
2.3.3.6 Limit kvantifikace (Quantitation Limit)
Limit kvantifikace se určuje stejně jako dolní limit detekce, jen nepředstavuje
trojnásobek, ale desetinásobek šumu a určuje množství, které je možné danou metodou ještě
nejen spolehlivě detekovat, ale také stanovit.
- 13 -
2.3.3.7 Robustnost (Robustness)
Robustnost analytické procedury je míra její kapacity zůstat neovlivněná malými,
ale náhodnými změnami v experimentálních parametrech. V případě HPLC by měla robustní
metoda dávat přijatelné výsledky (např. retenční čas, plocha píku, rozlišení) i když dochází
v experimentálních parametrech (např. složení mobilní fáze, pH, teplota kolony, průtoková
rychlost) k mírné odlišnosti od požadovaných v důsledku běžné nepřesnosti (např. nepřesnosti
odměrného nádobí, pomocných přístrojů). Robustnost je experimentálně zjišťována pomocí
záměrného vnášení malých změn do metody a zkoumání jejich důsledků.
3 Praktická část
3.1 Přístroje a zařízení
• HPLC systém 10 AVP fy SHIMADZU:
• odplyňovač GT-154
• systémová řídící jednotka SCL-10AVP
• pumpa LC-10AVP
• pícka CTO-10ASVP
• PDA detektor SPD-M10AVP
• řídící software Class-VP 5.02
• 2 monolitické kolony 100x4.6 mm, Onyx C18
• knihovna UV-VIS spekter purinů, pyrimidinů, nukleosidů a nukleotidů
• injekční stříkačka se speciálně upravenou jehlou pro dávkování vzorků
(Hamilton)
• mikropipety
• ultrazvuková lázeň
• odměrné baňky a další běžné laboratorní zařízení
3.2 Chemikálie
• standardy bází nukleotidů (koncentrace 10mM):
2’-deoxyinosin-5’-monofosfát (dIno)
inosin-5’-monofosfát (Ino)
2’-deoxyadenosin-5’-monofosfát (dAde)
adenosin-5’-monofosfát (Ade)
- 14 -
• thiomočovina (0,002% roztok ve vodě)
• mobilní fáze pro měření vzorků a standardů (vodný roztok fosfátu sodného
o koncentraci 15mM a pH 3,8; metanol pro chromatografii)
3.3 Postup – modelová optimalizace metody
V této části postupu je naznačeno, jak lze během optimalizace metody postupovat
s využitím ED a ANN. Vzhledem k tomu, že z časových důvodů nelze celý postup zvládnout
v laboratorním cvičení, budou zde pouze diskutovány jednotlivé aspekty tohoto přístupu
k optimalizaci s využitím reálných výsledků získaných při optimalizaci úlohy. Cílem je získat
optimální metodu separace dvou nukleosidů – adenosinu a inosinu – a jejich 2’-deoxy- forem.
3.3.1 Plán pokusů
Navrhněte parametry separace (průtok, teplota, složení mobilní fáze atd.), které je
vhodné optimalizovat (očekává se jejich vliv na separaci), a které je možno ponechat
konstantní (neočekává se jejich signifikantní vliv na separaci). U vybraných parametrů
k optimalizaci navrhněte rozpětí v jakém by měly být testovány a pomocí centrálně
kompozitního plánu (typ CCD III; viz. Obr. 4B) navrhněte potřebné experimenty. ~15 minut
3.3.2 Vytváření umělých neuronových sítí
Na základě plánu pokusů byly provedeny separace směsi (obsahující Ade, dAde,
Ino, dIno) za podmínek navržených v plánu pokusů. Určete vstupní neurony ANN. Navrhněte
jaké separační charakteristiky z chromatogramů (retenční časy, rozlišení, pološířky píků atd.)
lze nejlépe využít jako výstupní neurony umělých neuronových sítí. Důležité je přitom využití
předpovězených hodnot výstupních neuronů při posouzení vhodnosti separačních podmínek.
~15 minut
3.3.3 Trénování umělých neuronových sítí
Do ANN byla vložena vstupní a výstupní data získaná dle plánu pokusů.
Architektura sítě obsahovala jednu skrytou vrstvu. K trénování ANN byl použit program
Statistica. Natrénováno bylo celkem 100000 sítí. Nastavený rozsah neuronů ve skryté vrstvě
byl 3-15. Z natrénovaných sítí bylo programem podle RMS vybráno 100 nejlepších. K těmto
- 15 -
sítím byly vypočítány hodnoty RMS, MAE a jejich rozdíl. Na základě těchto hodnot vyberte
nejvhodnější síť pro predikci retenčních charakteristik separované směsi. ~15 minut
3.3.4 Výběr optimální mobilní fáze
Byla provedena separace modelové směsi (obsahující Ade, dAde, Ino, dIno) za
třech vybraných podmínek (viz. 3.3.3). Zhodnoťte reálné chování systému v porovnání
s předpovězenými hodnotami. Proveďte výběr optimální mobilní fáze. Do protokolu uveďte
procentuální odchylky předpovězených hodnot od naměřených a diskutujte rozdíly.
~10 minut
3.4 Postup - Validace metody
V této části budete provádět částečnou validaci optimalizované metody stanovení
čtyř analytů v modelovém vzorku. Pro přípravu směsi standardů použijte zásobní roztoky
o koncentraci 10mM.
V případě provádění opakování experimentů je vhodné provést také testování na
odlehlost krajních výsledků. V případě, že Vám testování odhalí odlehlý výsledek, zvažte jeho
vyloučení (vylučovat by se měla pouze ta data, která jsou zatížena hrubou chybou).
Pro intervaly spolehlivosti a testování statistické významnosti rozdílů si zvolte
hladinu významnosti 0,05 nebo 0,01. Problém volby hladiny významnosti si vysvětlíme na
případu, který budete při vypracovávání protokolu řešit – bod. 3.4.4. Hladina významnosti
znamená tzv. chybu I. druhu, tzn. pravděpodobnost, že zamítneme nulovou hypotézu i přes to,
že platí. Nulovou hypotézou může být např. tvrzení „pozorovaná výtěžnost metody je 100%“.
Pokud budeme testovat na hladině významnosti 0,05, počítáme s tím, že v pěti procentech
případů se stane, že nám vyjde rozdíl statisticky významný (tj. zamítneme rovnost námi
naměřenými a teoretickými výtěžnostmi) i přes to, že ve skutečnosti není. V případě, že
spočítáme intervaly spolehlivosti pro hladinu významnosti 0,01 vyjdou nám větší –
pravděpodobnost zamítnutí pravdivé nulové hypotézy (námi pozorovaná průměrná výtěžnost
se neliší od 100 %) tak bude logicky menší. Při výběru hladiny významnosti je proto vhodné
mít na paměti definici dané nulové hypotézy, kterou chci testovat a dle toho si pak zvolit
patřičnou pravděpodobnost, že ji zamítnu i když bude pravdivá.
- 16 -
3.4.1 Linearita
Linearitu ověřte měřením 7 (případně více) koncentrací standardu. Krajní
koncentrace je nutno volit tak, aby bylo možné určit dynamický rozsah metody – minimálně
jeden kalibrační bod u hladiny limitu detekce a jeden nad hranicí linearity. V našem případě
sestrojte kalibrační křivku v rozsahu 1-0,004mM. Sestrojte kalibrační závislost a určete
dynamický rozsah metody (body mimo dynamický rozsah do lineární závislosti nezařazujte,
pouze je zobrazte v kalibračním grafu). Pro lineární závislost otestujte významnost obou
parametrů lineární rovnice a např. pomocí programu Statistika zobrazte také příslušné
intervaly spolehlivosti. Nakonec určete zda je koeficient determinace větší než kritická
hodnota (viz. Tab. 1) a byla tak statisticky potvrzena linearita závislosti. ~1 hodina
3.4.2 Opakovatelnost
Připravte si směsi všech čtyř standardních látek v ekvimolárním množství na
3 koncentračních hladinách – 0,5; 0,05 a 0,005 mM. Každou směs změřte 5× za sebou. Pro
retenční čas a plochu píků vypočítejte směrodatnou odchylku (SD), relativní směrodatnou
odchylku (RSD) a intervaly spolehlivosti. ~1,75 hodiny
3.4.3 Dlouhodobá opakovatelnost
Pro zjištění dlouhodobé opakovatelnosti Vám budou poskytnuta data od kolegů,
kteří úlohu vypracovali před Vámi (minimálně 4 skupiny; celkem budete mít k dispozici
pětice hodnot). K výpočtu dlouhodobé opakovatelnosti vezměte vždy první měření pro
každou koncentrační hladinu. Jako variabilita se do dlouhodobé opakovatelnosti promítne
měření v delším časovém úseku a měření jiným pracovníkem. Dlouhodobou opakovatelnost
retenčních časů a ploch píků opět vyjádřete jako příslušné směrodatné odchylky (SD),
relativní směrodatné odchylky (RSD) a intervaly spolehlivosti na zvolené hladině
významnosti. Vyhodnocení této části dodejte
3.4.4 Správnost metody
Správnost metody ověřte změřením samotného modelového vzorku a vzorků
s přídavky všech čtyř standardů na dvou koncentračních úrovních (0,1 a 0,01mM). Měření
každého vzorku proveďte minimálně třikrát. Přídavek Správnost metody vyjádřete jako
výtěžnost v procentech pro kterou určete interval spolehlivosti na zvolené hladině
významnosti. Do protokolu uveďte mimo jiné „grafické“, případně početní zhodnocení
statistické významnosti rozdílu průměrné výtěžnosti metody a 100% hodnoty (bližší
- 17 -
informace viz. Poznámka ke statistickému zpracování, návod do podzimních laboratoří).
~1 hodina
3.4.5 Limit metody (LOD a LOQ)
LOD a LOQ zjistěte dvěma způsoby: 1) z kalibrační přímky a nástřiku slepého
vzorku (mobilní fáze, případně destilovaná voda jako rozpouštědlo ve vzorku) a 2) početní
metodou z chromatogramu získaného změřením směsi s nízkými obsahy analytů a patrným
šumem základní linie jak je popsáno v odstavci 2.3.3.5. Do protokolu uveďte porovnání takto
zjištěných limitů a v diskuzi srovnejte jejich správnost.
- 18 -