Ekotoxikologie
ekotoxicita ve vodách
molekulární toxikologie
Klára Hilscherová, Luděk Bláha a kol.
RECETOX PřF MU Brno
www.recetox.cz
• > 25 let zkušeností a expertízy (1983)
• původně Výzkumné centrum pro
chemii životního prostředí a ekotoxikologii
(založeno 1996 projekt PHARE)
• současnost – 6 divizí:
– Environmentální chemie a modelování
– Ekotoxikologie a hodnocení rizik
– Stopová analytická laboratoř
– Laboratoř analýzy dat
– Národní POPs centrum (2006)
– Regionální centrum Stockholmské konvence
pro budování kapacit a přenos technologií
v regionu střední a východní Evropy (2009)
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
RECETOX
(REsearch CEntre for TOXic compounds in the environment)
Environmentální osud a účinky polutantů
Lesní Požáry
Průmyslové Aktivity
Ropný průmysl
Zemědělství
Městské
aktivity
Vstup do vodního potravního řetězce
Bakteriální degradace
Depozice
Resuspendace
Rozpuštěn
á fáze
Koloidy
Částicová
fáze
Atmosferický
Transport
Depozice
Fotooxidace
Srážkové vody
Odpadní vody
Plankton Měkkýši Ryby Predátoři
Biotransformace
Akumulace/ Vyloučení
Toxické Účinky
Plynné emise
Ekotoxikologie na PřF MU
= hodnocení biologického vlivu stresorů od molekulární a buněčné
úrovně až po úroveň systémovou
• Odběry vzorků, terénní studie, laboratorní studie
• Hodnocení toxicity vzorků, jejich kontaminace
• Studium mechanismů toxicity i neletálních účinků na různých
trofických úrovních
• Celá řada ekotoxikologických modelů
Biochemická, molekulární a buněčná ekotoxikologie
Ekotoxikologie vodního prostředí
Ekotoxikologie půdního prostředí
Hodnocení environmentálních rizik, analýzy dat
AQUATOX
Ekotoxikologie vodního prostředí
Voda = základní podmínka života
Ekotoxikologie vodního prostředí
• Studium vlivu kontaminace vodního prostředí (vody, suspendovaných
částic, sedimentů) na organismy
• Serie biologických modelů - akutní i chronické účinky u zástupců
producentů, konzumentů a destruentů
• Kromě in vivo účinků (letalita, reprodukční toxicita, embryotoxicita apod.)
- biochemické odpovědi organismů jako časné známky toxických projevů
• Studium toxických účinků u jednotlivců,
i ekotoxikologie populací
a společenstev
NONPOINT SOURCES
Urban streets
Suburban
development
Wastewater
treatment
plant
Rural homes
Cropland
Factory
Animal feedlot
POINT
SOURCES
NONPOINT SOURCES
Urban streets
Suburban
development
Wastewater
treatment
plant
Rural homes
Cropland
Factory
Animal feedlot
POINT
SOURCES
Polutanty
Znečištění – zdravotní a ekologická rizika ?
Bioakumulace
Bioakumulace polutantů v tkánich organismů
Akvatická ekotoxikologie
Organismy používané pro
ekotoxikologické biotesty
Modely na všech úrovních potravního řetězce
– producenti - fotoautotrofní organismy,
řasy, sinice, vyšší rostliny
– konzumenti – vodní bezobratlí
obojživelníci
ryby, ptáci
– destruenti – bakterie, kvasinky
Účinky na fotoautotrofní organismy
• studium interakcí s cizorodými látkami, citlivosti druhů
Zelené řasy (Chlorophyta)
Sinice (Cyanophyta)
Skrytěnky
(Cryptophyta)
Rozsivky (Chromophyta)
Vyšší rostliny
Organismy používané pro ekotoxikologické
biotesty - konzumenti
Daphnia magna – Hrotnatka velká
Potamopyrgus antipodarum –
Písečník novozélandský
Pakomáři rodu Chironomus
Embrya obojživelníků (drápatky)
Embrya ryb (zebřička)
Spolupráce s VFU a MZLU – vliv environmentálních stresorů na ryby
Spolupráce s VFU - vliv environmentálních stresorů na ptáky
• Akutní, subchronické a chronické studie
• Standardní testy (normy ISO, ČSN, USEPA)
• Optimalizace/vývoj nových testů
• Studium mechanismů toxicity i neletálních
účinků
Testování čistých látek (environmentální polutanty)
Testování modelových směsí
Testování komplexních environmentálních extraktů
Moderní přístupy studia biochemických a
buněčných mechanismů.
Kvalitní přístrojové vybavení
Terénní studie
Odběry vzorků vodního prostředí
• Průzkum znečištění zájmových lokalit
• Odběry vod, sedimentů, bioty, bentosu, sinicové
biomasy
Zpracování vzorků
Biochemická, molekulární a buněčná
ekotoxikologie a genotoxikologie
Společenstvo Ekosystém
Individuum
Nespecifická
toxicita
Subletální účinekLetální účinek
Specifická toxicita
Genotoxicita
Karcinogenita
nepolární narkóza
polární narkóza
blokování respiračního
řetězce
inhibitor AchE
poškození CNS …
Reprodukční toxicita
Teratogenita
Neurotoxicita
Endokrinní toxicita
Populace
Parametry
populace
Strukturní a
funkční diverzita
Homeostáze a
homeorhéza
Vitalita/mortalita Růst/inhibice
ÚČINEK
• studium buněčných a biochemických mechanismů působení
toxických látek
• studium mechanismů ekotoxicity i specifických neletálních
účinků environmentálních polutantů, chronických typů toxicity
• využití in vitro testů specifických mechanismů toxicity a
genotoxicity
• mechanismy působení persistentních organických polutantů
(POPs) a cyanotoxinů produkovaných sinicemi při rozvoji
vodního květu
• In vivo biochemická ekotoxikologie
• In vitro toxikologie
Biochemická, molekulární a buněčná
ekotoxikologie a genotoxikologie
Speciální ekotoxikologické biotesty
– in vitro
• standardní testy (normy ISO, ČSN, USEPA)
• optimalizace/vývoj nových testů
• Toxicita
• Specifické mechanismy neletálních účinků
 Genotoxicita
 Dioxinová aktivita
 Mechanismy endokrinní disrupce – estrogenita,
androgenita
 Imunotoxicita
 Biochemická ekotoxicita
• Testování čistých látek (environmentální polutanty)
modelových směsí
komplexních environmentálních extraktů
(voda, sedimenty, půda,vzduch,
prachové částice, …)
In vitro toxikologie
In vitro testy pro hodnocení toxicity, genotoxicity i specifických mechanismů
neletálních účinků polutantů a jejich směsí
Testy na původních či geneticky modifikovaných prokaryotických či
eukaryotických buňkách
BAKTERIÁLNÍ TESTY, KVASINKOVÉ TESTY
TESTY NA TKÁŇOVÝCH KULTURÁCH (Laboratoř tkáňových kultur)
Metody proteomiky,
molekulární biologie
Moderní přístupy studia biochemických
a buněčných mechanismů – využití metod:
 Biochemie
 Imunologie
 Molekulární biologie
 Mikrobiologie
 Analytické chemie
!!! Možnost zajímavých bakalářských,
diplomových a doktorských projektů i
pro absolventy bakalářského či
magisterského studia jiných
biologických či chemických oborů
Farmaka ve vodách
v povrchových vodách se vyskytují
farmaceutické přípravky i další látky,
které člověk využívá v prostředcích
denní spotřeby.
reálné riziko pro vodní ekosystém v
podobě působení těchto aktivních látek
na organismy
nejvíce informací o působení
steroidních farmak a antibiotik
• účinnost odstraňování farmak na ČOV není 100%
 ČOV ve Frankfurtu 7-96%
- porovnání koncentrace ve vtoku a výtoku z čistírny
 nedostatečné technologie čištění zvyšují přítomnost farmak ve vodách
 koncentrace pod ČOV klesají pro každý typ látky různě
• nejvíce sledované skupiny léčiv:
humánní – analgetika a protizánětlivé látky, antibiotika, orální kontraceptiva,
cytostatika, antiepileptika, betablokátory, hypolipidemika, RTG-kontrastní média,
hormony a různé sloučeniny a metabolity
veterinární – antibiotika, antiektoparazitika, desinficiencia
• vlastnosti léčiv - biologicky aktivní
Farmaka ve vodách
látky environmentálně zajímavé
potenciálně nebezpečné !
• Účinky farmak a jejich metabolitů jsou v podstatě stejné jako účinky
dalších xenobiotik v prostředí
PŘÍKLADY VLIVU NA NECÍLOVÉ ORGANISMY
• antibiotika – likvidace důležitých mikroorganismů v ekosystému
– vznik rezistencí patogenních bakterií vůči ATB!!!!
• antiepileptika – neurodegenerace
mozku vodních organismů při vývoji
• antidepresiva – neurotoxicita
• cytostatika – genotoxicita a další efekty
• steroidní farmaka včetně antikoncepce
 endokrinní disrupce
Farmaka ve vodách
 narušení hormonální rovnováhy organismů - potenciální negativní
následky pro celkovou homeostázu, reprodukční, vývojové funkce a
chování
• endokrinní systém - společně s CNS hlavní systém řízení organismu
 udržování homeostázy organismu
 podpora růstu buněk
 koordinace vývoje
 reprodukce
 zprostředkování odpovědi na vnější
impulsy (chování)
Hormonálně aktivní látky v prostředí
Endokrinní disrupce
Působení endokrinních disruptorů
 přímo - vazba na receptor x blokování receptoru
 nepřímo – ovlivnění syntézy, metabolismu
a dostupnosti přirozených hormonů
• následky endokrinní disrupce u vodních organismů
 narušení růstu a vývoje (a nižší přežívání mláďat); embryonální malformace
 potlačení gametogeneze (ovogeneze i spermatogeneze)
 vznik hermafroditů, maskulinizace samic a feminizace samců
 neplodnost a poruchy chování
 poruchy svlékání a růstu; poruchy imunitního systému
 promoce karcinogeneze
vymizení populací
ovlivnění populací ovlivnění ekosystému !!!
Lidské hormony:
estrogeny v antikoncepčních přípravcích
Kidd, K.A. et al. 2007. Collapse of a fish population
following exposure to a synthetic estrogen. Proceedings
of the National Academy of Sciences 104(21):8897-8901
Controls +Ethinylestradiol
5 ng/L (!)
7 years
HO
OH
Mechanismů je mnoho (známé / neznámé)
co známe: působení na tzv. „jaderné receptory“
Jak EDC fungují ?
 STEROIDNÍ HORMONY (ER, AR, GR..)
Estrogeny, androgeny
Glukokortikoidy, mineralokortikoidy
 THYROIDNÍ HORMONY (ThR)
Řízení růstu
 RETINOIDY (RAR/RXR)
Vývoj, embryogeneze, vidění …
HO
OH
H3C CH3
CH3 CH3
COOH
CH3
Benz[a]anthracen Benzo[a]pyren
Benzo[k]flluoranthen Cyclopenta[cd]pyren
„Přirozené“ ligandy jaderných receptorů
Reporterové testy s luciferázou
savčí buňky, kvasinky, umělé in vitro systémy
Nástroje pro sledování endokrinní disrupce
- mechanismus přes jaderné receptory -
Estrogenita
Androgenita
Toxicita závislá na
retinoidech
Využití biologických nástrojů – příklady
Aktivní vzorkování (léto)
částice vs. plynná fáze
• Referenční lokalita – zemědělská
oblast (observatoř Košetice)
• Region A – chemický průmysl
(OCPs, Středočeský kraj)
• Region B – výroba barev,
zemědělství, doprava
(Uherskohradišťsko)
Novák et al. (2009) Environment International
Příkladová studie – Specifické účinky látek v ovzduší
Chemické látky vs. ED-toxicita ve vzduchu
PCBs
0.001
0.01
0.1
1
REF 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
A B
ng/m
3
log10
particle phase
gas phase
OCPs
0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
REF 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
A B
ng/m3
log10
particle phase
gas phase
PAHs
0.1
1
10
100
1000
REF 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
A B
ng/m3
log10
particle phase
gas phase
Chemické analýzy:
+/- žádné trendy, žádné
velké rozdíly mezi
oblastmi,
antiandrogenicity
0.1
1
10
100
1000
REF 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
A B
1/IC25(1/(m3
/ml)log10)
particle phase
gas phase
BIOTESTY …velké rozdíly v EFEKTECH !
antiestrogenicity
0.01
0.1
1
10
REF 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
A B
1/IC25(1/m3
/mllog10)
particle phase
gas phase
dioxin-like toxicity
0.1
1
10
100
REF 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
A B
TEQ(ng/m3
log10)
particle phase
gas phase
Příkladová studie – ČOV Brno
Čistírna odpadních vod Brno - Modřice
- roční studie (vstup/výstup; May 2007 – April 2008)
- kompozitní vzorky (24h), každý měsíc - 12 období
- příprava pro testování (SPE a analýza účinků)
 Účinnost odstraňování 81 až >98%
 ČOV vstup : 5 to 147 ng EEQ/L (equivalenty E2)
výstup 0.1 - 4 ng EEQ/L
0
25
50
75
100
125
150
175
M
ay
07June
07
July
07August07
Septem
ber07O
ctober07
N
ovem
ber07
D
ecem
ber07January
08
February
08M
arch
08April08
ngEEQ/L
Influent Effluent
Příklad
estrogenita
HO
OH
Příkladová studie – ČOV Brno
 Říční voda nad a pod ČOV (obce 4000 až 13000 obyvatel)
 Menší vodní toky nezatížené dalšími většími zdroji znečištění
 Vzorkování – pasivní vzorkovače POCIS (21 dní)
Příkladová studie 2 – Malá sídla / ČOV
0
1
2
3
4
5
nad
Králíky
pod
Králíky
nad
Jilem
nicí
pod
Jilem
nicí
nad
C
vikovem
pod
C
vikovem
nad
Tachovem
pod
Tachovem
nad
Volaram
a
pod
Volaram
a
nad
Vim
perkem
pod
Vim
prekem
nad
Prachaticem
i
pod
Prachaticem
i
ngEEQ/POCIS
POCIS Pest POCIS Pharm
 Detekce estrogenity
0,06 ng až 4,50 ng
EEQ/POCIS
 V řekách pod ČOV
více estrogenní vzorky
ve všech případech
 Cvikov a Prachatice
nejvyšší estrogenní
potenciál
Příkladová studie 2 – Malá sídla / ČOV
ESTROGENITA
Nádrž Pilňok
• Region Ostrava-Karviná
Rak bahenní
Pontastacus leptodactylus
INTERSEX
Samice s mužskými gonopody?
Samec s vajíčky?
Reálný problém EDCs v ČR
Sedimenty
• Pilňok
• Referenční lokality
Karviná, Steinlach (Německo)
Extrakce
Chemické
analýzy
In vitro
účinky
In vivo účinky
Bláha et al. (2006) Environment International
Mazurová et al. (2008) Aquatic Toxicology
Mazurová et al. (2010) Journal of Soils and Sediments
Integrované hodnocení
Masový rozvoj sinic – globální problém
Upper Saranac River, USA
Lake Mokoan, Austrálie
Neuse River, USA
Baltské moře, Evropa
Jihoafrická republikaŽluté moře, Čína
Nové Mlýny, Česko
Bedetti Lake, Argentina
Toxické sinice
SINICE (CYANOBAKTERIE)
• masový rozvoj sinic = závažný problém:
• komplikace při využívání nádrží
(vodárenství, rekreace, chov ryb)
• nebezpečí pro ostatní živé organismy
 negativní vliv na chemismus vody (kyslík, pH, )
 produkce pachů, pachutí
 produkce CYANOTOXINŮ – látky toxické či jinak
biologicky aktivní
! LIDSKÉ AKTIVITY !
CYANOTOXINY
masový rozvoj sinic
(vodní květy)
NH
NH
O
O
CH3
NH
NH
NH
N
NH
O
O
O
OCH3
CH3 CH3
H3C
O
COOH CH3
COOH
H3C
O
H2C
CH3
CH3
NH
NH2HN
H2N
O
O
+H2N
H
OH
OH
NH2
+
NH
NHN
NH
N N H N H NH
N H
O
O
O H
HH
O 3S O
H 3C
H
N H
O
C H 3
eutrofizace vodních
ekosystémů
CYANOTOXINY
spalování
zemědělství,
odpadní vody
nárůst koncentrace CO2
v atmosféře, nárůst UV
radiace
sinice
(cyanobaktérie)
GLOBÁLNÍ
ENVIRONMENTÁLNÍ
PROBLÉM
Výzkum toxických účinků cyanobakterií a jejich
frakcí na:
 Vodní fotoautotrofní organismy
 Vodní bezobratlé - korýše – hrotnatka velká
Daphnia magna - akutní a chronické účinky
 Larvy obojživelníků a ryb – testy embryotoxicity a
teratogeneze s embryi obojživelníků a ryb – drápatka
vodní, zebřička pruhovaná
 Ryby, ptáky – spolupráce s Veterinární a farmaceutickou
universitou v Brně
 In vitro testy – buněčné linie – produkce bioaktivních
metabolitů
Bakalářky a diplomky
• Endokrinní disruptory a další polární
látky (léčiva, vonné látky, pesticidy)
v prostředí
– hladiny a efekty (kde jsou?, jak moc?)
– možnosti praktického sledování
(estrogenita, senzory, kity pro praxi…)
– účinky na vodní organismy
– možnosti odstraňování
• Sinice a jejich toxiny
• Proč sinice produkují peptidové
microcystiny ?
• Jaký je význam těchto látek ?
• Nové a neznámé látky ?
• Neznámé účinky ?
• Akumulace toxinů v rybách a jejich
účinky (vč. biochemických)
• Hodnocení kontaminace a
toxických účinků ovzduší
• Studium působení
huminových látek,
interakce s polutanty,
ovlivnění jejich osudu a
toxicity
• Studium zatížení říčních
sedimentů, dynamika
znečištění
• Toxické indexy dle
výskytu bioindikačních
druhů v bentických
společenstvech
Kamenice 126/3, Brno – Bohunice
Tel: 549 49 4267, 775 140 071
Fax: 549 492 840
E-mail: hilscherova@recetox.muni.cz
Zástupce pro výuku:
Jakub Hofman - hofman@recetox.muni.cz
Den otevřených dveří….
www.recetox.muni.cz