Biologická technika – zoologická část
!!! Bezpečnost práce !!!
– ochranný oděv (plášť) + dlouhé vlasy do gumičky + přezůvky
Eva Řehulková
Co potřebujete na zápočet?
 100% účast na praktiku (absence nahrazení)
 Odevzdání protokolů (v následujícím cvičení)
 Test (závěrečné cvičení)
Struktura protokolu:
1. Teoretický úvod (vysvětlení základních pojmů)
2. Postup přípravy preparátů
3. Nákres preparátů měkkou tužkou
4. Popis nákresu – tužkou (velké, nestínovat, nešrafovat)
Světelná mikroskopie - historie
Čočky a brýle
Nimrudská čočka – 2000 př.n.l. krystal sloužící
buď jako zvětšovací sklo nebo k podpalování
ohňů, nebo součást teleskopu
Egypt – 8.stol. př.n.l. – hieroglyfy zobrazují
používání čočky
Řecko 1.stol.n.l. – čočka použita pro koncentraci
slunečních paprsků a zapálení ohně,
smaragd císaře Nera - korekční pomůcka/sluneční
brýle - k pozorování gladiátorských zápasů
Kolem r. 1000 n.l. – tzv. „čtecí kameny“, sférické
sklo, pokládaly se na text
První evropské "prabrýle" - čočky korigující vidění
zasazené do obrouček - se objevily v Itálii v
druhé části 13. stol. a jako vynálezce je uváděn
Alessandro de Spina z Florencie. V té době se
brýle již nějaký čas používaly nejen v Evropě,
ale i v Číně, není však známo, na
kterém kontinentu dřív.
replika kostěných
brýlí – 15 stol.
Hans a Zacharias Janssenovi
První složený mikroskop zvětšoval 3x při zatažení tubusu a 9x při
max. roztažení (měřil 1,2 m).
Holandský výrobce brýlí Hans Janssen se svým
synem Zachariasem Janssenem údajně poprvé
zkonstruovali mikroskop složený z více čoček.
O vynálezu existuje pouze záznam z pozdější doby
v dílech spisovatelů Pierre Borela (1620-1671)
a Willema Boreela (1591-1668).
1590
Galileo Galilei (1564-1642) zkonstruoval první
mikroskop složený ze spojky a rozptylky, nazval ho
occhiolino.
1609
Cornelius Drebbel (1572-1633) předvedl v Londýně
mikroskop založený na dvou spojných čočkách.
Nákres mikroskopu se zachoval na zadní straně
Drebbelova dopisu králi Jamesovi I.
1619
Řecky Micron = malý a scopos = cíl
Giovanni Faber z Bambergu (1574 -1629)
používá poprvé slovo mikroskop odvozené od
slova teleskop.
1625
Robert Hooke
- složený mikroskop
1665
Micrographia
- sledování tenkých řezů korkem - pojem BUŇKA
Antony van Leeuwenhoek
(1632 - 1723)
Jednoduchý mikroskop (1660, 1674)
Konvexní skleněná čočka byla připevněna
do kovového držáku a byla zaostřována
pomocí šroubu.
čočka
zaostřovací
šroub
držák vzorku
Mikroskopy 17. století
Mikroskopy 18. století
Mikroskopy 19. století
Mikroskopy 20.století
Světelný mikroskop - základní pracovní nástroj
Účel mikroskopu:
• zvětšení
• rozlišení detailů
• kontrast
Olympus BX 50: Fázový kontrast
Olympus BX 50: Nomarského kontrast
Olympus BX 50: procházející světlo
Jednoduchý mikroskop
jedna čočka nebo jeden systém čoček (lupa)
Složený mikroskop
více systémů čoček
Jaký je rozdíl mezi binokulárním mikroskopem a stereomikroskopem?
Stereomikroskop má dvě
samostatné optické dráhy – pro
pravé a levé oko zvlášť. Toto
uspořádání poskytuje prostorové
vidění, trojrozměrný pohled a
přímý obraz. Čím je větší úhel φ
tím je výraznější stereovjem
ČÁST MECHANICKÁ:
stativ, tubus, revolverový
měnič objektivů, stolek,
makrošroub, mikrošroub,
vypínač, ovládání intenzity
světla
ČÁST OSVĚTLOVACÍ:
zdroj světla, zrcátko, polní
clona, kondenzor,
aperturní clona
ČÁST OPTICKÁ:
objektivy, okuláry
Složení mikroskopu CX 31
Část mechanická
Stativ - tvoří pevnou dolní část mikroskopu. Někdy se ještě rozlišuje na nohu a pevné
rameno (zejména u starších typů mikroskopů). Do stativu je zabudováno u moderních
mikroskopů osvětlení, u starších typů se prosvětlení preparátu provádělo pomocí
zrcátka, které odráželo denní světlo nebo světlo z nezávislé lampy.
Stolek - je u běžných mikroskopů tzv. křížový, což znamená, že umožňuje pohyb preparátu
v pravoúhlém systému souřadnic, takže je možné si zaznamenat polohu nalezeného
objektu a později se k němu vrátit. Pohyb stolku je ovládán dvěma šrouby, jedním pro
pohyb podle x-ové souřadnice, druhý pro y-ovou souřadnici. Podložní sklo s preparátem
se vkládá do držáku neboli vodiče preparátu a je přidržováno ramínkem s pružinou.
Revolverový měnič objektivů - umožňuje plynulou výměnu jednotlivých
objektivů při zachování optické osy a hrubého zaostření bez pohybu stolku (tj.
zachovává nalezenou pozici na preparátu)
Tubus - trubice spojující objektiv s okulárem, která zabraňuje vstupu rušivého
světla z okolí. U moderních mikroskopů jsou uvnitř tubusu hranoly rozdělující
světelný paprsek přicházející z objektivu do dvou svazků, nasměrovaných do
dvou okulárů (binokulární mikroskop), případně se odděluje část paprsků pro
snímání obrazu kamerou (trinokulární uspořádání). Binokulární nástavec
umožňuje nastavení vzdálenosti okulárů dle vzdálenosti očí pozorovatele a
nezávislé zaostření obrazu v každém okuláru (viz dále okuláry).
Mechanická (optická) délka tubusu - vzdálenost mezi horním a dolním
koncem tubusu, mění se vzájemným posunem dvou na sebe nasunutých
částí,
1. dána výrobcem (160 - 170 mm) a je nutno ji dodržovat - objektivy a okuláry
konstrukčně přizpůsobeny
2. nekonečná délka tubusu (vkládání modulů), , objektivy s korekcí na
nekonečno (soustava čoček)
Zaostřovací šrouby (makro- na hrubé ostření a mikro- na jemné doostření),
které ovládají svislý pohyb rampy, na kterou je připojen jednak vlastní stolek,
na nějž se umisťuje preparát, jednak nosič kondenzoru.
Vypínač, ovládání intenzity světla
Část mechanická
ČÁST OSVĚTLOVACÍ
Pozorování ve světle procházejícím x dopadajícím
Zdroj světla - lampa v noze stativu s kolektorovou čočkou (fixně seřízená), kolektor
spolu se zrcátkem soustřeďuje světlo do kondenzoru
V dnešní době se pro běžnou světelnou mikroskopii používají nejčastěji
wolfram-halogenové lampy, které se umisťují do osvětlovací komůrky
zabudované do spodní části stativu. Při výměně lampy je třeba dodržovat dvě
zásady:
1. zahřátou lampu nechat vždy dostatečně vychladnout (20 min.), protože se při
práci zahřívá na velmi vysokou teplotu
2. nikdy nesahat na sklo lampy, protože otisky prstů se vpálí během používání do
skla a zkracují životnost lampy; při výměně proto držíme novou lampu přes
vnější obal.
Proud světla vycházející z lampy bývá usměrněn sběrnou čočkou do světelného
kanálu ukončeného polní clonou, která vymezuje maximální velikost
osvětleného pole (používá se při malém zvětšení, viz práce s mikroskopem).
Mezi sběrnou čočku a polní clonu se mohou umisťovat speciální filtry (pro
vyvážení barev, pro specifickou absorpci určité barvy) zlepšující kontrast.
ČÁST OSVĚTLOVACÍ
Kondenzor - soustřeďuje světlo ze světelného zdroje do kužele,
který
1. rovnoměrně osvětluje preparát
2. odpovídá numerické apertuře objektivu
Při změně objektivu je vhodné upravit N.A. kondenzoru
aperturní clonou
N.A. kondenzoru = 80% N.A. objektivu
Aperturní clona (kondenzorová, irisová) - umístěna před vlastní soustavu
kondenzorových čoček a vymezuje šířku proudu světla, který prochází
kondenzorovými čočkami.
- reguluje množství světla přicházejícího do mikroskopu, stupnice, podle které
se nastavuje numerická apertura kondenzoru
Typy kondenzorů
Abbeův - nejjednodušší, N.A. = 1,25
- není korigován chromaticky ani
sféricky, vhodný pro jednoduché objektivy
Aplanatický – korekce sférické vady
Achromatický – korekce chromatické vady
Aplanaticko-apochromatický – korigován pro obě
vady
ČÁST OSVĚTLOVACÍ
Chromatická vada
-souvisí s tím, že ohnisková vzdálenost čočky závisí na
indexu lomu a ten se mění podle barvy použitého světla
(tedy podle vlnové délky). Bílé světlo je však složeno z
různých vlnových délek a každá jeho složka (tzn. každá
barva) se při průchodu čočkou láme trochu jinak. Při
průchodu čočkou s barevnou vadou tedy dochází k rozkladu
světla.
V důsledku této vady je obrazem bodu bod určité barvy,
který je obklopen mezikružím jiných barev.
Chromatickou vadu lze alespoň částečně odstranit vhodnou
kombinací spojných a rozptylných čoček (achromatický
doublet), což se nazývá achromatizací optické soustavy
VADY OPTICKÉHO ZOBRAZOVÁNÍ
http://www.olympusmi
cro.com/primer/java/a
berrations/chromatic/in
dex.html
Vady čoček jsou způsobeny jednak vlastním materiálem
čoček (vada sférická, astigmatická, koma, vyklenutí
zorného pole a distorze), jednak nehomogenním
charakterem bílého světla (chromatická vada).
Sférická vada
Její příčinou je odlišná ohnisková vzdálenost
pro různě vzdálené paprsky od optické osy.
Sférická (též kulová nebo otvorová) vada
vzniká tehdy, pokud na čočku dopadá široký
svazek paprsků rovnoběžných s osou, přičemž
paraxiální paprsky se za čočkou setkávají v
jiném bodě než okrajové paprsky širokého
svazku. (Jako paraxiální paprsky označujeme
paprsky v blízkosti optické osy přístroje, které s
touto osou svírají jen malý úhel, jsou s ní tedy
téměř rovnoběžné)
Tato vada způsobuje, že obrazem bodu není
bod, ale rozmazaná kruhová ploška.
Tuto vadu lze také částečně kompenzovat
kombinací čoček.
http://www.olympusmicro.com/p
rimer/java/aberrations/spherical/
index.html
VADY OPTICKÉHO ZOBRAZOVÁNÍ
Vyklenutí (rovinnost)
zorného pole
Vada souvisí s tím, že body ležící v
rovině rovnoběžné s ohniskovou rovinou
nevytvoří ostrý obraz na rovinu snímače,
ale na zakřivenou plochu, a to vypuklou
nebo vydutou. Obraz roviny kolmé k
optické ose se tak zobrazí na zakřivené
ploše, čímž dochází k rozmazání a
neostrosti. Znamená to, že můžeme
zaostřit buď na kraj nebo na střed
pole.
http://www.olympusmicro.com/primer/java/aberrations/curv
atureoffield/index.html
VADY OPTICKÉHO ZOBRAZOVÁNÍ
ČÁST OPTICKÁ
Značení objektivů
Vytváří zvětšený převrácený a skutečný obraz předmětu
Čím je kratší ohnisková vzdálenost objektivu, tím je větší zvětšení
Objektivy - Nejdůležitější optická součást mikroskopu
0.5 ×
1- 1.25 ×
2 – 2,5 x Typy imerze
4 ×, 5 × (proužek blíže k preparátu)
10 ×
20 × Olej
40 ×, 50 × Voda
Glycerol
60 ×
100 ×
150 ×, 250 ×
Zvětšení objektivů
ČÁST OPTICKÁ
Achromáty - korigovánu chromatickou vadu pro dvě vlnové délky
(červené a modré světlo) a sférickou vadu pro zelené světlo. Nejlepších
výsledků dosahují při použití zeleného filtru a černobílých filmů pro
mikrofotografii.
Fluority (semi-apochromáty)
- chromaticky pro modré, zelené a červené
světlo
- sférická vada pro modré a zelené světlo
- vhodné pro barevné zobrazení
jejich název vychází z historického postupu výroby - dělaly se z kazivcového (fluoritového) skla. Nyní
již tomu tak není, ale protože jsou objektivy určeny hlavně pro fluorescenční aplikace (vynikající optické
vlastnosti, dobře propouští UV záření), a jejich název fluorescenci evokuje, není důvod jej měnit. Jsou
vhodné i pro pozorování ve světlém poli.
Apochromáty - chromaticky pro krátkovlnné modré,
zelené a červené světlo
- sférická vada pro krátkovlnné
modré a zelené světlo
- nejvyšší kvalita barevného zobrazení
Plan- korigováno vyklenutí zorného pole
Korekce objektivů
ČÁST OPTICKÁ
Typy objektivů
Objektiv by měl poskytovat co nejkvalitnější zobrazení
Kvalita objektivu je určena stupněm korekce optických aberací a
rovinností obrazového pole
PlanAch
ApoFl
ČÁST OPTICKÁ
Korekce vady zklenutí zorného pole - PLAN
Důležitá zejména pro záznam obrazu
Rozdíl mezi Ach a Plan Ach
ČÁST OPTICKÁ
Pracovní vzdálenost: Vzdálenost mezi preparátem a
nejnižším bodem objektivu (větší zvětšení – menší PV)
Rozlišovací schopnost: Schopnost rozlišit dva body, tzn. že vyjadřuje
minimální vzdálenost dvou objektů tak, aby byly vnímány jako dva
jednotlivé objekty
Hloubka ostrosti: Hloubka obrazu, v níž bude zaostřený obraz rovnoměrně
ostrý. Hloubka ostrosti se zvětšuje se zavíráním aperturní clony. S rostoucí
numerickou aperturou objektivu hloubka ostrosti klesá
Číslo pole: Průměr zorného pole okuláru (v mm)
Průměr zorného pole: Skutečný průměr pozorovaného pole v mikroskopu (v
milimetrech)
Celkové zvětšení: Součin zvětšení objektivu a zvětšení okuláru
Numerická apertura: Numerická apertura je číselná hodnota. S rostoucí
numerickou aperturou roste i rozlišovací schopnost objektivu
Další charakteristiky objektivu
ČÁST OPTICKÁ
Numerická apertura objektivu
Numerická apertura (N.A.) = n × sin
N.A. ≥ 1 nelze dosáhnout bez imerze
Se zvětšením roste numerická apertura objektivu
http://www.olympusmicro
.com/primer/java/nuapert
ure/index.html
ČÁST OPTICKÁ
Objektivy pro práci bez krycího skla - NCG (no cover glass)-
hematologie
Objektivy s dlouhou nebo ultradlouhou pracovní vzdáleností
Objektivy s korekcí na tloušťku krycího skla - korekční prstenec
Objektivy s irisovou clonou - omezení světelného toku objektivem, vliv
na hloubku ostrosti
Odpružené objektivy - zamezení mechanickému doteku čočky
Objektivy pro speciální pracovní postupy - např. fázový kontrast, DIC
Suché objektivy - mezi objektivem a krycím sklem je vzduch
Imerzní objektivy - imerzní olej (mezi objektiv a krycí sklo, mezi přední
čočku kondenzoru a podložní sklo)
http://www.olympusmicro.com/primer/java/aberrations/slip
correction2/index.html
ČÁST OPTICKÁ
Homogenní imerzní systém
Význam použití imerze
Frontální
čočka
kondenzoru
Imerzní
olej
objekt
Krycí sklo
Imerzní olej
Frontální čočka
objektivu
Uzavírací
médium
Imerzní média index lomu
materiál Index lomu
vzduch 1,0003
voda 1,333
glycerin 1,4695
Parafinový olej 1,480
Cedrový olej 1,515
Syntetický olej 1,515
anisol 1,5178
bromonaftalen 1,6585
metylenjodid 1,740
ČÁST OPTICKÁ
Okulár
Pro optimalizaci výsledků je potřeba vybírat okuláry odpovídající použitým objektivům (jejich typu a korekci
vad).
Zvětšuje obraz vytvořený objektivem
Zvětšení okuláru je prázdné - nezobrazuje více detailů,
než bylo zobrazeno objektivem
Podle uspořádání čoček a pevné clony se okuláry dělí na:
negativní (Huygensovy)
pozitivní (Ramsdenovy) - umožňuje snadnou montáž měřítka – pozor na prach
Typy okulárů
Huygensův okulár H - skládá se ze 2 čoček, v kombinaci se slabými objektivy (achromáty)
Ortoskopické okuláry O - nezkreslují zorné pole, v kombinaci s objektivy achromatickými a
planachromatickými
Kompenzační okuláry K - kompenzují chromatickou vadu objektivů, jsou určeny pro práci s
apochromáty
Periplanatické okuláry P - kompenzují chromatické vady a částečně i vyklenutí zorného pole,
v kombinaci s planachromatickými objektivy
Průměr zorného pole (FN - field number) - 18 - 22 mm,
širokoúhlé okuláry (UW) - až 25 mm
Projektivy - okulár používaný při mikrofotografii
Brill okuláry - umožňují pozorování a kompenzaci pro dioptrické oko, dioptrická korekce,
manžety
ČÁST OPTICKÁ
Okulár
Maximální užitečné zvětšení mikroskopu je však určeno i
rozlišovací schopností objektivu. Za podmínek, kdy je
minimální vzdálenost dvou rozlišitelných bodů srovnatelná s
rozlišovací schopností lidského oka, obraz se nezlepší ani při
použití silně zvětšujících okulárů, kdy dostaneme jen
rozměrnější obraz bez nových detailů.
Zvětšení mikroskopu
Zvětšení obrazu mikroskopem je dáno zvětšením okulárů a
zvětšením objektivu.
Užitečné zvětšení mikroskopu:
- Minimální – numerická apertura objektivu x 500
- Maximální – numerická apertura objektivu x 1000
Užitečné zvětšení mikroskopu
Celkové zvětšení ≤ 1000 × N.A. objektivu
Příklad 1:
Objektiv 40 ×, N.A. = 0,65
Okuláry 15 × 40 × 15 = 600 ≤ 650 O.K.
Příklad 2:
Objektiv 100 ×, N.A. = 1,3
Okuláry 15 × 100 × 15 = 1500 > 1300 ×
Okuláry 12,5 × 100 × 12,5 = 1250 ≤ 1300 O.K.
Pozor na další zvětšení při přenosu digitálního obrazu na
monitor!
prázdné zvětšení !!!
Měření mikroskopických objektů
v horizontální rovině, kolmé na optickou osu, se provádí
pomocí okulárového a objektivového mikrometru
Okulárový mikrometr je skleněná destička, opatřená měřící stupnicí.
Mikrometrická stupnice se umisťuje do roviny polní clony okuláru, tj. do
přední ohniskové roviny očnice okuláru, takže se nezobrazuje celým
mikroskopem, ale jen okulárem.Neměří se jím tedy vlastní objekt, ale
jeho obraz, respektive meziobraz, vytvořený v rovině clony. Aby se z
velikosti obrazu, vyjádřené určitým počtem dílků okulárového
mikrometru, odvodila skutečná velikost měřeného objektu, musí se
dotyčný počet dílků mikrometru znásobit mikrometrickou hodnotou. Tato
hodnota, závislá na zvětšení a mechanické tubusové délce, se získává
vzájemným pozorováním stupnic okulárového a objektivového
mikrometru.
Mikrometrobjektiv je destička formátu podložního skla, opatřená
mikrometrickou stupnicí, kde 1 mm je rozdělený na 100 dílků, 1 dílek = 0,01
mm = 10 mikronů. Stupnice je chráněna krycím sklem. Objektivový slouží jako
délkový standard pro cejchování stupnice okulárového mikrometru a k určení
zvětšení mikroskopu, nebo k určení měřítka zobrazení objektu mikrofotografií
nebo kresbou.
měřící okulár
měřítko
mikrometrobjektiv
Postup při měření délky, šířky či průměru mikroskopických objektů
1. kalibrace: místo obyčejného okuláru vložíme okulár s mikrometrem a místo
preparátu objektivový mikrometr (1 mm je na něm rozdělen na 100 dílků, takže
jeden dílek odpovídá 10 μm). Při použití určitého objektivu srovnáme obrazy obou
mikrometrů tak, že se jejich stupnice kryjí a odečteme, kolika dílkům objektivového
mikrometru odpovídá kolik dílků okulárového mikrometru. Vypočítáme tzv.
mikrometrický koeficient pro daný objektiv (tj. kolika mikrometrům odpovídá jeden
dílek okulárového mikrometru při použití daného objektivu) vypočítáme jako
(a : b) . 10 [μm]
10 dílků měřícího okuláru
= 75 dílkům mikrometrobjektivu
tj. (750 µm)
1 dílek MO = 75 µm
Průměr cévy na preparátu = 70 dílků
MO = 70 x 75 µm
Postup práce s mikroskopem
Mikroskop přenášíme oběma rukama (kapotáž) !!!
Manipulujeme pouze pomocí vroubkovaných částí !!!
1. Zapneme mikroskop, vložíme preparát, zařadíme objektiv 10x
nastavíme osvětlení, zaostříme na preparát.
2. Nastavíme vzdálenost okulárů a provedeme dioptrickou korekci
(okulár bez dioptru zaostříme na objekt mikrošroubem, zavřeme oko;
okulár s dioptrem doostříme podle svého oka).
Použití manžet: při pozorování s brýlemi ponechte manžety ohrnuté,
nikdy manžety neodstraňovat z hygienických důvodů !!!
3. Nastavíme aperturní clonu kondenzoru.
4. Při použití jiného objektivu doostříme mikrošroubem a nastavíme
odpovídající aperturní clonu.
5. Zařadíme filtr, přizpůsobíme osvětlení a pozorujeme.
Köhlerovo osvětlení nastavujeme do optimální polohy:
• clonu osvětlovacího systému
• clonu kondenzoru
• polohu kondenzoru
1. Umístíme preparát a zaostříme s objektivem 10x
2. Uzavřeme polní clonu
3. Kondenzor snižujeme nebo zvyšujeme tak dlouho, až je obraz
svítícího pole ostře ohraničený
4. Polní clonu otevřeme tak, aby se dotýkala okrajů zorného
pole.
5. Obraz svítícího pole posuneme centrovacími šrouby
kondenzoru do středu zorného pole
http://www.olympusm
icro.com/primer/java/
microscopy/kohler/in
dex.html
Výsledkem Köhlerova nastaveni je rovnoměrné a maximální osvětlení
preparátu, ležícího v předmětové rovině. Současně by měla být dosažena
nejlepší kombinace mezi rozlišovací schopností a kontrastem.
Potřeby pro mikroskopování
Krycí skla -různá tloušťka (0,08; 0,11; 0,13;0,17;0,20 mm)
- velikost (mm) a tvar
Podložní skla - různá tloušťka (1; 1,2 mm) velikost (26 x 70 mm)
- zabroušené hrany, matované
Preparační soustavy - pinzeta, skalpel, nůžky, preparační jehly, štětec,
pipeta
Laboratorní sklo - Petriho miska, hodinové sklo, kádinka atd.
Krabice na preparáty
Slohy na preparáty
KVALITA ZOBRAZENÍ BIOLOGICKÝCH OBJEKTŮ ZÁVISÍ NA
1. dostatečném zvětšení obrazu (pozor na maximální užitečné
zvětšení = numerická apertura objektivu x 1000)
2. rozlišovací schopnosti mikroskopu (závisí na numerické
apertuře objektivu a kondenzoru a kvalitě osvětlení
preparátu , tj. optimálním nastavení Koehlerova osvětlení)
3. kontrastu obrazu, který lze efektivně zvýšit pomocí
a) cytologických a histologických barviv
b) optických metod, které převádějí rozdíly v indexu lomu
různě tlustých částí objektů na jasový kontrast obrazu
Kontrastní metody
Slouží k zvýšení kontrastu obrazu tak, aby byl dobře
pozorovatelný.
Nejpoužívanější metody:
Temné pole
Fázový kontrast
Polarizované světlo
Reliéfní kontrast
Diferenciální interferenční kontrast
Fluorescence
Fyzikální principy fázového kontrastu nejsou snadno
přístupné. Naopak praktické používání fázového
kontrastu ve světlené mikroskopii nečiní většinou
žádné potíže. Stručně můžeme říci, že lidské oko je
schopno vnímat rozdíly v amplitudě světelného
vlnění jako rozdílnou intenzitu světla a rozdíly ve
vlnové délce jako různou barvu světla. Nezbarvené
(průhledné) objekty jsou pro světlo téměř všude
stejně prostupné, ale protože jejich různé části mají
různou optickou hustotu, lomí světlo každá z nich
pod jiným úhlem. V důsledku toho se světelné
paprsky vystupující z preparátu liší fází svého
vlnění, amplituda zůstává nezměněna. Změna fáze
světla, která nastává při průchodu objektem, není
zrakem přímo viditelná. Nemá-li tedy objekt detaily,
lišící se kontrastem, je pro lidský zrak průhledný,
čirý. U řady biologických objektů tyto vlastnosti
převažují a proto je zrakem obtížně identifikujeme.
Mikroskop, vybavený pro pozorování ve fázovém
kontrastu, nám umožňuje pozorovat i takové objekty,
které způsobují jen fázový posun světla. Hlubší
poznatky o tomto principu jsou součástí fyzikální
optiky.
Metoda fázového kontrastu
amplituda - intenzita světla
vlnová délka - barva
fázový posun - neviditelný pro lidské oko
vlnová
délka λ
amplit
uda
λ/
4
!!Metoda převádí rozdíly fází na rozdíly intenzit.
Fázový kontrast
Na kondenzor se umístí maska s kruhovou štěrbinou,
kterou proniká světlo do objektu. V objektivu, v místě
obrazu kondenzorové masky, je umístěna fázová maska.
V místě šterbiny u kondenzorové masky je u masky fázové
napařená polopropustná vrstva kovu, která mění fázi světla
o čtvrtinu vlnové délky. Díky tomuto uspořádání prochází
nedifraktované (neohnuté) záření ze zdroje (štěrbiny
kondenzorové masky) tou částí fázové masky, která mění
fázi světla. Ostatní vlnění, které se na objektu ohnulo a
nebo zlomilo, projde beze změny. Při interferenci vln
v obrazové rovině se části objektu, které různým způsobem
mění fázi světla projeví různou intenzitou světla. Tato
technika tedy převádí rozdíly v posunu fáze světla
procházejícího různými částmi objektu, které nevidíme,
na rozdíly v intenzitě světla, kterou můžeme pozorovat.
Frits Zernike, 1934 - Nobelova
cena
Fázový kontrast
Metoda fázového kontrastu
Frits Zernike, 1934 - Nobelova cena
Karl Zeiss, Jena
ZAŘÍZENÍ PRO FÁZOVÝ KONTRAST
změna fáze vlnění na změnu amplitudy
=
viditelné pro člověka
Průvodní jev fázového
kontrastu:
„aureola“ (haló efekt) –
světlý obrys
kolem objektu
Objektivy pro fázový kontrast - fázová destička
(převádí neviditelné fázové rozdíly na
rozdíly amplitudové)
Kondenzor - aperturní kroužek pro různé zvětšení
Centrovací dalekohled - seřízení fázových prstenců
Zelený filtr- 540 nm
fázová destička (difrakční ploška)
objekt
kondenzor
objektiv
Kondenzorová maska (štěrbinová
apertura)
http://www.microscopyu.com/tutorials/java/phasecontrast/microscopealignment/index.html
Seřízení fázových destiček
http://www.olympusmicro.com/primer/java/phasecontrast/phasemicroscope/index.html
procházející světlo x fázový kontrast
vzniknou dva identické obrazy objektu,
které jsou vůči sobě laterálně posunuty
různá tloušťka preparátu = fázové rozdíly
Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)
- povrchová topologie objektu
kolem 1950, Georges Nomarski
mikroskop - 1959 Carl Zeiss
polarizátor
Wollastonův hranol
kondenzor
preparát
objektiv
Wollastonův hranol
analyzátor
lineární polarizace světla
rozdělení polarizovaného světla na
dvě složky
interference dvou laterálně
posunutých obrazů a srovnání
fázových rozdílů v celé ploše obrazu
zvětšený obraz vzorku se jeví jako
šikmo osvětlený trojrozměrný objekt
pylové zrno borovice
Ancylostoma
duodenale Clonorchis sinensis
červené krvinky
řez ledvinou myši
příchytné svorky diplozoona
Fázový kontrast DIC
Nové technologie
• mikroskop s videokamerou
• spojení počítače s mikroskopem
• digitalizace a analýza obrazu
DIGITÁLNÍ MIKROSKOP Olympus MIC-D
Místo klasického pozorování pomocí okulárů
zobrazuje MIC-D na monitoru osobního počítače,
který je s mikroskopem spojen USB kabelem.
Protože se jedná o digitální obraz, jeho zpracování
je velmi rychlé a snadné: uživatel jej může uložit,
vymazat, upravit, vytisknout, umístit na web nebo
poslat e-mailem.
Čočka z kapky vody
• Model na základě Leeuwenhoekova mikroskopu si můžete snadno sestrojit. Jeden z
nejjednodušších se dá vyrobit jen pomocí kancelářské svorky. Kleštěmi nejdřív svorku
narovnejte (na to je lepší použít kleště s plochými čelistmi). Jeden konec zahněte do
smyčky. Ta by měla mít průměr asi 1,5 mm a být co nejkulatější. Snažte se přitom moc
nepoškrábat kov, ze kterého je smyčka vyrobena. Potom potřete smyčku trochou oleje nebo
sádla, aby dostala jemný povlak. Ponořte ji do vody (nejlépe destilované) a pak ji pomalu
vytáhněte ven. Kapka vody, která se na ní uchytí, bude fungovat jako čočka. Není tak silná
jako čočky z Leeuwenhoekova mikroskopu, ale má stejný sférický tvar a bude zvětšovat 2x
nebo i vícekrát.
Malý mikroskop
• Můžete si vyrobit i malý mikroskop, který se hodí na pozorování drobných vzorků. Ustřihněte
plechový pásek o velikosti 10 cm * 2,5 cm například z nějaké plechovky od jídla. Pokud jsou
hrany ostré, zapilujte je. V kovovém pásku vyvrtejte uprostřed dírku o průměru 2,5 mm. Ať
uděláte tuto dírku jakýmkoli způsobem, snažte se, aby byla co nejkulatější a byla bez
otřepů. Pro očištění je dobré okolí dírky přeleštit smirkovým papírem. Potom odfoukněte
případný prach, který tam zůstal.
• Ohněte konce kovového pásku dolů, aby jste ho mohli postavit (jako stoleček). Na pásek
dejte, stejně jako v předcházejícím případě, olej nebo sádlo a tužkou pak přeneste na tuto
dírku kapku vody tak, aby v ní zůstala. Na nějaké podložky (například plechovky) položte
kus skla, jak je to ukázáno na obrázku. Opatrně pak pásek postavte do středu skla a dávejte
pozor, ať nevylijete "čočku". Pod sklem podepřete malé zrcátko tak, aby se světlo z něho
odráželo nahoru skrz čočku. Cokoli, co chcete prozkoumat (pyl, malý hmyz, zrnko soli nebo
písku atd.), pak dejte pod čočku. Zaostřujte jemným zatlačením na plíšek.
Zdroj: FyzWeb
Vyrobte si „mikroskop“
Kreslící zařízení
Studené světlo