Příprava mikroskopických preparátů
zhotovení - objekt uzavřeme do vhodného média a prohlížíme mezi
sklem podložním a krycím
uzavírací médium - tekuté nebo tuhnoucí
X - mikroskopické preparáty bez média (vzduch)
Podložní sklo
uzavírací médium
krycí sklo
objekt
Nativní preparát, vitální barveníNativní preparáty, vitální barvení
Podle trvanlivosti:
Druhy preparátů
Trvalé – fixovaný materiál
Dočasné - nativní, čerstvé
Druhy preparátů
Druhy preparátů
Podle způsoby přípravy:
• totální (celé objekty)
Médium:
kanadský balzám
Parazit (objekt):
Ctenocephalides felis
Hostitel:
Felis silvestris f. catus
Parazit (objekt):
Dicrocoelium dendriticum
Hostitel:
Ovis ammon f. aries
Barvení: železitý
acetokarmín
Médium:
kanadský balzám
1. roztěry (z tekutin, v nichž jsou rozptýleny drobné objekty)
Druhy preparátů
Podle způsoby přípravy:
- vlhké (střevní
prvoci)
Objekt: Giardia
intestinalis
- suché (krevní
roztěry, spermie)
2. Vlhká komůrka (visutá kapka s objekty)
Druhy preparátů
Podle způsoby přípravy:
Objekt:
Volvox
3. Výbrusy (tvrdý materiál - kosti, zuby)
Objekt:
kost
Druhy preparátů
Podle způsoby přípravy:
4. Řezové preparáty (histologické řezy – polotenké, tenké,
tlusté řezy žiletkou)
5. Roztlaky (karyotypy)
Objekt: ledvina
savce
Objekt: obří
chromozómy,
slinné žlázy
larvy pakomára
výhody: neporušený objekt
možnost pozorovat pohyb buněk
činnost organel - pohyb bičíků, řasinek, kontraktilní vakuoly
nevýhody: omezený výběr materiálu (velikost, sezóna)
časové omezení
malé rozdíly v přirozeném kontrastu
izolované buňky (krev, lymfa, leukocyty, roztlačené vazivo,chrupavka na
řezech, pozorování buněčného dělení, průkaz vajíček,
cyst nebo vegetativních stádií střevních parazitů
ve stolici, tvar a struktura buněk kvasinek atd.)
drobné organismy
studium nativních preparátů - nejstarší metoda v biologii
Nativní preparáty
• suché preparáty
• přirozené prostředí - pro volně žijící organismy (voda sladká, mořská)
umělé izotonické prostředí - fyziologický roztok, krevní sérum,
NaCl v destilované vodě,
Ringerův roztok, Lockeho roztok
kroužkovci - 0,45% NaCl
ryby, obojživelníci - 0,64% NaCl
plazi - 0,80% NaCl
ptáci, savci - 0,90% NaCl
Tekutiny pro nativní preparáty
Pleurosigma
(Diatomaceae)
Suchý preparát.
Temné pole.
Mikroskop
AMPLIVAL ZEISS
Jena.
1. Kapka média do středu podložního
skla (pozor na velikost kapky)
2. Vložíme objekt, správně orientujeme
3. Přikryjeme krycím sklíčkem
4. Stolek mikroskopu ani podložní sklo
nesmí být vlhké
5. Médium nesmí být na krycím skle
6. Přebytek média – odsajeme od hrany
krycího skla
7. Nedostatek média – přikápneme k
hraně krycího skla – prosaje se
8. V preparátu nesmějí být bubliny
Příprava nativního preparátu
Jak položit krycí sklíčko?
- hranou na podložní sklo pod úhlem 45°, podepřít jehlou a přiklopit
- uchopit za hrany do dvou prstů, položit kolmo shora
Příprava nativního preparátu
Barvení (buněk, tkáně) za živa je vitální barvení
Do živé buňky pronikají pouze tzv. vitální barviva
Vodné roztoky barviv o nízké koncentraci
(zásobní 0,5 -1%, k použití se silně ředí - až 0,05%
možnost rozpustit ve fyziologických tekutinách
Barvení je biochemická metoda, kterou se přidá k objektu specifická barvící látka
(barvivo) a slouží k prokázání výskytu (kvalifikaci) nebo množství (kvantifikaci) specifické
látky ve zkoumaném objektu nebo ke zvýraznění vnitřních struktur.
Vitální barvení
Objekt: ameba
Médium: voda
Barvení: vitální
Intravitální
Barví se normální živé buňky, přímo v těle organismu
Drobné objekty se vkládají přímo do nízkoprocentních roztoků těchto
barviv, nebo se vstřikují do živého organizmu (obratlovci)
nebo tzv. prosáváním
Příklad:
neutrální červeň potravní
vakuoly
vakuoly
Filtrační
papírek
Druhy barvení
Médium:
voda
Barvení:
vitální
Objekt:
Paramecium
caudatum
Supravitální - barvíme živé buňky vybrané z těla (kousky tkáně)
propustnost membrán je větší u oslabených buněk
Druhy barvení
Supra vital stain in hemoglobin H disease that reveals Heinz bodies (golf ball appearance).
Postvitální - barví se odumírající buňky
Příklad:
metylová zeleň - makronukleus
nálevníků
Druhy barvení
Spirostomum minus which I stained with Methyl Green Acetic the
long macronucleus.
Neutrální červeň
Barví potravní vakuoly - soustavy vakuol, tzv. vakuom ( potravní vakuoly u
buněčného jícnu mají kyselý obsah – malinově červené, vakuoly vzdálenější jsou
žlutočervené - alkalické prostředí) - změna chemizmu během cyklózy (tj.
cytoplazmatického proudění – distribuce živin, metabolitů, organel, ….). NČ je
indikátorom pH daného prostředí. Používaná koncentrace 1:50 000 – 100 000.
Kongo červeň
Barví potravní vakuoly a cytoplazmu ( u jícnu modré, vzadu červené - v závislosti
na kyselosti). Používaná koncentrace 1:10 000. U perlooček barví chemoreceptory
na antenulách.
Janusova zeleň B
Barví mitochondrie černě (drobné černé tečky v plazmě). 1:10 000
Metylénová zeleň
Příklad barvení postvitálního, zabarví makronukleus odumírající trepky (je velmi
citlivá na alkalické prostředí, proto se používá v slabě kyselém prostředí- do 1%
vodního roztoku kápneme několik kapek kyseliny octové)
Metylová modř
- obsah vakuol tmavomodrý, u živočichů též neurony
Metylová violet
- cytoplazmatické granulky na fialovo, po delší době i jádro
Barviva a selektivní vazba barviva na určité buněčné struktury
Pro pozorování v mikroskopu nutno zpomalit rychlý pohyb trepky
Používá se:
• nejjednodušší je mírný tlak na krycí sklo pomocí jehly (!!! pozor na rozdrcení
objektů)
• zaklínění mezi řasy a detrit
• komůrky z vaty
• zahuštění prostředí:
1%agar- 1 kapka zahřátá na 40oC
rosol se semen druhu Cydonia vulgaris (kdoule)
3% roztok želatiny nebo metylcelulózy
řídký škrob
• narkotizace: parami éteru, dioxid uhličitý, metylalkohol, chlorid horečnatý,
kyselina octová
• ochlazení preparátu
Úkol č. 1
Modelový organismus – trepka (Paramecium sp.), zhotovení nativního
preparátu, vitální barvení
1. Na podložní sklo kápneme kapku vody s
trepkami
2. Vložíme rozcupovanou vatu a přikryjeme
krycím sklem (zpomalení pohybu)
3. Pozorujeme práci kontraktilních vakuol
4. Barvíme:
a) intravitálně neutrální červení – potravní
vakuoly (různé pH)
b) postvitálně metylenovou zelení –
makronukleus
Trepky: „zrnková“ kultura
- zpomalení pohybu: (vlákna vaty, želatina,
metylcelulóza, páry éteru, kyselina octová)
Úkol č. 1
Modelový organismus – trepka (Paramecium sp.), zhotovení nativního
preparátu, vitální barvení
Trepka se rozmnožuje
většinou nepohlavně. Jedinec
vyroste na dospělém a jednici
a po čase se oddělí. Trepky
mají i pohlavní rozmnožování.
Nazývá se konjugace. Jedinci
splynou buněčnými ústy,
generativní jádro prodělá
redukční dělení, vegetativní
se 2X rozpadá. Následuje
vznik 4 jader, 3 z nich zanikají
a čtvrté se haploidně rozdělí
na 2. Jádra v buňkách
splynou v synkarion.
Konjuganti se rozestoupí.
Následují 3 za sebou jdoucí
jaderná dělení. Výsledkem
konjugace je vznik 8 trepek.
Konjugace trepek – fázový
kontrast