Fixace
Uzavírací média
Co je to fixace…
• Tkáně a orgány po zástavě přísunu kyslíku rychle podléhají
autolýze, která je způsobena degradací buněčného
obsahu uvolněnými enzymy. K zamezení autolýzy se
používá fixace, jejíž podstata tkví v koagulaci a denaturaci
bílkovin buněk a tkání.
• Fixace je děj cílený, při kterém se objekty rychle usmrtí
nebo se zastaví již započaté autolytické pochody.
• Fixace objektů (organizmů, vzorků z tkání a orgánů) se
provádí pomocí fixačních prostředků, které se rozdělují na
fyzikální a chemické.
Fixační prostředek musí…
• rychle pronikat do objektů
• co nejvíce zachovávat strukturu tkáně, orgánu nebo
celého objektu
• zachovat barvitelnost tkáně
Jak správně fixovat…
• pokud možno živé objekty (organizmy, buňky,
tkáně)
• menší živočichy fixujeme celé
• větší před fixací narkotizujeme
• dostatečné množství fixační tekutiny
Fixační prostředky
Fyzikální fixační prostředky
• fixace suchým teplem nebo varem
• lyofilizace (vyschnutí za nízké teploty; rychlé zmražení → sublimace
zmrzlé vody při nízkém tlaku a teplotě v sušárně)
• mrazová substituce
Dvě poslední procedury nejsou fixací v pravém slova smyslu,
protože proteiny jsou denaturovány pouze v omezené míře
a zachovávají si antigenní vlastnosti.
Chemické fixační prostředky
Etanol, metanol, aceton
- extrahují lipidy a tkáň po nich značně ztvrdne a smrští se
- používají se většinou jen ve směsích
Organické kyseliny
- octová, trichloroctová a kyselina pikrová, která se užívá v podobě
nasyceného vodního roztoku v kombinaci s formolem a kyselinou
octovou (Bouinova tekutina)
Sloučeniny těžkých kovů
- chlorid rtuťnatý (sublimát, HgCl2), soli chromu (K2Cr2O7) a oxid
osmičelý (OsO4), který kvalitně zachovává strukturu tkáně,
strukturu membrán a jemně gelifikuje proteiny. Jeho nevýhodou je
pomalý průnik do tkáně, inhibice enzymů a vysoká toxicita
Chemické fixační prostředky
Aldehydy: fixačním prostředkem číslo jedna je formaldehyd. Používá
se zpravidla v 2-5 % koncentraci, doba fixace je 12-24 h.
Formaldehyd uchovává zejména dobře proteiny a lipidy, nikoliv
sacharidy. Při delším stání (hlavně na světle) částečně oxiduje v
metanol a kyselinu mravenčí → znehodnocení a nekvalitní fixace.
Nežádoucí příměs kyseliny mravenčí lze z formaldehydu odstranit
práškovým uhličitanem vápenatým. Je třeba mít na zřeteli, že
formaldehydové páry jsou agresivní a dráždivé! Glutaraldehyd ze
skupiny dialdehydů kvalitně uchovává strukturu buněk a zčásti i
aktivitu enzymatických bílkovin. Proto našel uplatnění zejména v
elektronové mikroskopii, histochemii a ultrahistochemii. K dobré
fixaci postačuje doba 2-4 h v pufrovaném roztoku.
Fixační směsi : Bouin, Suza, Zenker, Sublimát-alkohol, Davidson,
AFA
Etanol (alkohol, etylalkohol, líh,..)
- fixuje pouze ve vysoké koncentraci (70-100%)
- dodává se 96%-ní
- ředění destilovanou vodou
- denaturovaný 1% benzinu
- v nižší koncentraci: špatně proniká, smršťuje tkáň, rozpouští tuky
- při dlouhodobém uložení objektů v alkoholu→ snižování
barvitelnosti
- čistý etanol – analýza DNA
Metanol (absolutní)
- pro fixaci krevních nátěrů
- je jedovatý
Formaldehyd
- 35-40%-ní roztok = 100% formol
- použití – 4%, ředí se obyčejnou vodou
- bezbarvý, dráždivý, na světle rozkládající →kyselina mravenčí
(uchovávaní v hnědých lahvích)
- výhody: dobře sráží bílkoviny, dobře proniká, nerozpouští tuky a
lipidy, dobře konzervuje, levný, jednoduchá příprava,…
Kyselina octová (100%)
- krystalizuje při 17˚ C → ledová kyselina octová
- používá se ve fixačních směsích (se sublimátem, k. chromovou a k.
osmičelou)
- kyselou reakcí usnadňuje a urychluje fixační účinek vlastních
fixačních složek a zlepšuje barvitelnost
Sublimát (chlorid rtuťnatý)
- nejpoužívanější ze solí těžkých kovů
- tvoří bílé krystalky dobře rozpustné ve vodě a alkoholu
- jedovatý!
- používá se ve směsích (např. sublimát-k. octová, sublimát-alkohol)
- zachovává barvitelnost tkání, dobrá fixace jádra
- po fixaci zbývá ve tkáni sraženiny rtuti →artefakty (odstranění
jodovou tinkturou nebo alkoholovým roztokem jodjodkalia po přidání
do 70%-ního alkoholu-barva koňaku)
- výborný pro fixaci vlhkých roztěrů
Bouinova fixáž
- nejpoužívanější fixační směs
- směs nasyceného vodného roztoku kyseliny pikrové, 30%
formaldehydu a kyseliny octové → žlutá barva (kyselina pikrová)
- výhody: dobře proniká a fixuje, snadná příprava, objekty se po ní
dobře barví, nemusí se z tkáně dlouho vypírat,..
- průměrná doba fixace: 24h→vypírání v 70%-ním alkoholu
- použití: řezové preparáty, skanovací elektronová mikroskopie
Uzavírací média
Funkce:
- pozorovací prostředí (průhledné, bezbarvé, optimální index lomu)
- konzervace (x rozklad tkáně)
- zachování zbarvení (nesmí odbarvovat nabarvené preparáty)
musí být pod celou plochou krycího sklíčka !!!
1) s vodou mísitelná
• glycerol
• glycerin-želatina
• Liquido-Faure
Rozdělení
2) s vodou nemísitelná
• Kanadský balzám
• Dammara
• syntetické pryskyřice (Eukitt)
Uzavírací média s vodou mísitelná
- montování neobarvených objektů (projasnění)
Glycerol (glycerín)
- mísí se s alkoholem i vodou
- vysoký index lomu (1,45)
- objekty do něho nemůžeme uzavřít přímo→ smrštění, potrhání
- objekty fixované vodními fixážemi převádíme nejdříve do glycerinu s
vodou (1:10 x 1:5)
- objekty fixované alkoholem převádíme do glycerinu s alkoholem (1:10 x
1:5) → vodu nebo alkohol necháme odpařit → rámeček
Glycerol-želatina
= směs želatiny (tuhne), glycerol (projasňuje), destilovaná voda,
krystalický fenol (proti plísni)
- rozehřátí ve zkumavce na vodní lázni
→ přenos na objekt na podložním sklíčku
→ překrytí krycím sklíčkem (bez bublin!)
→ očištění od přebytečného média
→ omytí formaldehydem, rámování
- použití: drobní korýši, hmyz,..
- nevhodné pro uzavírání barvených objektů → odbarvení
Liquido-Faure
Swanovo médium, Berlesovo médium, Hoyerova
směs atd.
- složení: destilovaná voda, arabská klovatina
glycerol, chloralhydrát
- výhody: může se současně používat jako fixační
prostředek, dobře tuhne, nevyžaduje rámování
- vhodný pro uzavírání málo průhledných objektů→
projasnění
- nevhodný pro: barvené objekty→ odbarvení
- sušení preparátů v termostatu (40°C)
Polyvinylalkohol + kyselina mléčná
- bílý prášek (PVA)
- použití: textilní a farmaceutický průmysl
- pro přípravu uzavíracího média: 15% roztok PVA v destilované vodě
- projasňovací schopnost (k. mléčná)
- sušení v teple, nerámuje se
- použití: roztoči, vajíčka hlístic, korýši
Liquido-Faure:
Varroa destructor
nejdříve kapka média, rychle
přenést objekt, ponořit do média
a orientovat ho, přikrýt krycím
sklem - nerámuje se
sušit v termostatu při 40;C
Glycerol - šupiny ryb rámovat
Glycerol-želatina: larva muchničky
rámovat komára, pakomára
ktenoidní cykloidní
chvostoskok Podura aquatica