Téma 06:    Struktura pestíků a prašníků lilie

                                   B. Krájení parafínových řezů


Ke studiu detailní struktury stavby rostlinných orgánů se obvykle používají parafínové řezy
připravované pomocí přístroje na získávání tenkých řezů, tzv. mikrotomů. Mikrotomy jsou
konstruovány buď jako rotační nebo sáňkové. Tloušťka řezů závisí na  charakteru objektu, většinou
se pohybuje od 6 do 15 mm.


Rostlinný materiál:   segmenty prašníků a pestíků květních poupat lilie zalitých do parafínu v roce
2011 (viz protokol 06_301_lilie_2011_postup)


Vzorky:          301.1.  segmenty prašníků poupěte 5 cm dlouhého

301.2.    segmenty prašníků poupěte 6 cm dlouhého

301.3.    segmenty prašníků poupěte 9 cm dlouhého

301.4.    segmenty pestíku (blizna, čnělka, semeník) poupěte 5 cm dlouhého

301.5.    segmenty pestíku (blizna, čnělka, semeník) poupěte 6 cm dlouhého

301.6.    segmenty pestíku (blizna, čnělka, semeník) poupěte 9 cm dlouhého


Mikrotom Reichert, podložní skla potažená tenkou lepící vrstvou chrómové želatiny, žiletky, štětce,
tužka s diamantovým hrotem, nahřívací ploténka.


Příprava chrómové želatiny (Pappas 1971)

            100 ml destilované vody

            0,5 g želatiny

            0,05 g síranu chromito-draselného


1.                 V odlitém malém množství vody rozpustit kamenec (bude se přidávat až do
rozpuštěné želatiny).

2.                 Želatinu nechat nejdříve nabobtnat, pak mírně nahřát a rozpustit ( na vodní
lázni) a smíchat s roztokem kamence.

3.                 Po vychladnutí filtrovat přes filtrační papír Whatman1.

4.                 Vychladlým roztokem protáhnout dokonale odmaštěná podložní skla, vytvoří se
rovnoměrný tenký povlak želatiny.  Při nedokonalém odmaštění podložních skel nedochází k adhezi
želatiny na povrch skel.

5.                 Skla se vysušit ve svislé poloze a uložit na bezprašném místě. Mohou se i
nějakou dobu skladovat (pro delší skladování je vhodnější uchování v ledničce).

Poznámka:

Roztok chromové želatiny je možno skladovat při 5°C 48 hodin.

Později již není vhodné směs používat.


Postup krájení parafínových řezů:


1.      Parafínový blok s orientovanými segmenty vzorků rozdělíme naříznutím žiletkou a rozlomením
napřed na pruhy s jednou řadou vzorků a následně oddělíme stejným způsobem parafínový bloček
s jedním objektem.

2.      Pomocí zahřátého skalpelu přitavíme parafínový bloček na dřevěný špalíček, který upevníme
do svěráku Neapolské svorky sáňkového mikrotomu Reichert vybaveného držákem mikrotomových čepelek.
V případě potřeby mažeme sáňky mikrotomu parafínovým olejem, aby byl hladký pohyb bloku s nožem.

3.      Žiletkou seřízneme (trimujeme) parafínový bloček do tvaru komolé pyramidy tak, aby vrstva
parafínu kolem objektu byla přiměřená a hrany souběžné s ostřím nože mikrotomu byly rovnoběžné
(parafínová páska pak bude rovná).

4.      Nastavíme pozici Neapolské svorky tak, abychom získali příčné řezy objektem.

5.      Nastavíme požadovanou tloušťku řezů a vhodný sklon nože.

6.      Opakovaným pohybem sáněk mikrotomu s držákem mikrotomových čepelek krájíme jednotlivé řezy
požadované tloušťky, které se spojují v tzv. pásku.

7.      Pásku přenášíme pomocí navlhčených štětců (pozor na ostří nože mikrotomu) na tmavou
podložku, kde je krájíme podle velikosti plánovaného krycího skla. Musíme počítat s tím, že páska
se po nažehlení vyrovná a prodlouží. Při přenosu pásky sledujeme pořadí řezů, klademe je na sklo
zleva doprava. Spodní strana řezů je lesklá.

8.      Segmenty parafínové pásky přenášíme na vodní hladinu na podložním skle potaženém chrómovou
želatinou.

9.      Na vyhřáté ploténce se voda zahřeje a parafínová páska se vyrovná. Po usušení vody jsou
řezy pevně přilepené na podložním skle a je možné s nimi manipulovat v kyvetách při procesu barvení
řezů. Nakrájené a vysušené řezy je možné před barvením skladovat i delší dobu v suchém a bezprašném
místě.


Literatura:


1.            Kiernan, J. (1981): Histological and histochemical methods: Theory and practise.
1.Ed. Oxford: Pergamon Press, 344 s.

2.            Lux, A., Erdelská, O. (1998): Praktikum z anatómie a embryológie rastlín. Bratislava
: Univerzita Komenského, 135 s. ISBN 80-223-1229-0.

3.            Pazourková, Z. (1982): Botanická mikrotechnika. 1. vyd. Praha: Univerzita Karlova,
166 s.

4.            Pappas, P.W. (1971): The use of chrome alum-gelatin (subbing) solution as a general
adhesive for paraffin sections. Stain Technol., 46: 121-124.



http://kfrserver.natur.cuni.cz/cz/edu/mikro/prep/tprep.htm