Téma 06:    Struktura pestíků a prašníků lilie

                                   C. Barvení parafínových řezů


Parafínové řezy nalepené na podložních sklech napřed odparafínujeme v xylenu. Pro účinnější
rozpuštění parafínu je vhodné před vložením do xylenu skla zahřát na ploténce. Podle způsobu
barvení se řezy rehydratují do příslušné koncentrace ethanolu nebo až do vody. Po nabarvení se řezy
opět odvodňují, převádějí do xylenu a uzavírají do média nemísitelného s vodou, kterým je buď
pryskyřice přírodní (kanadský balzám) nebo syntetická.

Pro přenášení podložních skel s řezy v jednotlivých lázních barvícího procesu se nejlépe osvědčují
Hellendalovy skleněné kyvety, které jsou vyšší než podložní sklo a dvě protilehlé vnitřní strany
mají opatřeny drážkami, do kterých se jednotlivá skla zasouvají vertikálně. Kyvety naplňujeme
uvedenými roztoky tak, aby byla celá skla ponořená.


Materiál:  podložní skla s nalepenými parafínovými řezy, Hellendalovy skleněné kyvety, ethanolová
řada, 1% alcianová modř v 1% kyselině octové,  0,1% jaderná červeň stálá v 5% roztoku
Al[2](SO[4])[3 ](Kernechtrot, nuclear fast red = antrachinonové barvivo C.I. No 60760).


Příprava 0,1% barvícího laku jaderné červeni

1.                 Připravíme 5% roztok Al[2](SO[4])[3 ] (10 g síranu do 190 ml destilované vody)

2.                 Rozpustíme barvivo jaderná červeň stálá (0,2 g barviva ve 200 g roztoku síranu)

3.                 Směs zahříváme na vodní lázni na 80^oC, aby se vytvořil hlinitý  komplex a po
vychladnutí ji filtrujeme.

Doba trvanlivosti barviva je několik měsíců. Lze ji prodloužit opakovaným zahřátím před každým
použitím. Před barvením roztok vždy filtrujeme.



Postup barvení parafínových řezů podvojnou metodou:

alciánová modř a pravá jaderná červeň (Beneš a Kamínek 1973)


1.      Parafín z řezů rozpustíme v xylenu (alespoň 2 lázně).

2.      Sestupnou etanolovou řadou převedeme řezy do destilované vody.

3.      Řezy okyselíme v 3% roztoku kyseliny octové po dobu 10 min.

4.      Řezy barvíme v 1% alcianové modři v 1% kyselině octové po dobu 10 minut.

5.      Řezy krátce opláchneme v 3% kyselině octové a necháme propírat pod tekoucí vodovodní vodou
po dobu 10 min.

6.      Následně  se řezy barví v 0,1% jaderné červeni stálé v 5% roztoku Al[2](SO[4])[3] po dobu 5
- 15 minut.

7.      Řezy dobře promyjeme v destilované vodě (2 – 3 lázně), odvodníme ve stoupající etanolové
řadě a převedeme do xylenu.

8.      Očistíme krycí skla a řezy uzavřeme do syntetické pryskyřice Eukitt®.


Hodnocení:

Po zatuhnutí uzavíracího média hodnotíme kvalitu vlastních řezů, způsob a intenzitu vybarvení
struktur.

Na obarvených preparátech pak studujeme vývoj prašníků a gyneceí lilie. Pokusíme se zjistit
vývojové stadium pylu a vajíčka.

Výsledky dokumentujeme kresbou s popisem a mikrofotografií.


Poznámka:

Jméno „Kernechtrot“ se používají různé firmy pro různá barviva (Miller a Chytil 1966).

Kernechtrot fy Fluka = antrachinonové barvivo C.I. No 60760

Kernechtrot-Herzberg (Nuclear fast red-Herzberg) fy E. Gurr  je barvivo podobné neutrální červeni,
ale struktura není známá

Kernechtrot (Nuclear fast red) fy Dajac = diazo sůl

Kernechtrot (Nuclear fast red) for calcium fy E.Gurr (Michrome No 1022) = struktura není známá

Kernechtrotsaltz B (Nuclear Fast Red B) - diazo sůl  C.I. No 37125

Kernechtrotsaltz R (Nuclear Fast Red R) - diazo sůl C.I. No 37130

Pouze antrachinonové barvivo tvoří chelát s hlinitou solí a je vhodné pro tento barvící postup.


Literatura:


1.            Beneš, K., Kamínek, M. (1973): The use of aluminium lake of nuclear fast red in plant
material successively with alcian blue. Biologia Plantarum, 15 (4): 294 – 297.

2.            Green, F.J. 1990. The Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators. Aldrich
Chemical Comnpany, Milwaukee.

3.            Kiernan, J. (1981): Histological and histochemical methods: Theory and practise. 1^st
Ed. Oxford: Pergamon Press, 344 p.

4.            Lillie, R.D. 1977. H.J. Conn's Biological Stains, 9^th Ed.  Williams & Wilkins,
Baltimore.

5.            Lux, A., Erdelská, O. (1998): Praktikum z anatómie a embryológie rastlín. Bratislava
: Univerzita Komenského, 135 s.

6.            Miller J. a Chytil F. (1966) : Barviva v mikroskopické technice, Academia Praha, 376
s.

7.            Pazourková, Z. (1982): Botanická mikrotechnika. 1. vyd. Praha: Univerzita Karlova,
166 s.

8.            Sheenan, D.C., B.B. Hrapchak. Theory and practice of histotechnology, 2^nd Ed.
Battelle Press, Columbus.  pp. 172-173.


http://kfrserver.natur.cuni.cz/cz/edu/mikro/prep/tprep.htm