Práce se sekvenčními daty (DNA) Práce se sekvenčními daty Sekvence - zápis posloupnosti jednoznačných znaků odpovídajících jednotlivým zbytkům (monomerům), které se nacházejí v odpovídající posloupnosti v dané makromolekule ♦ DNA nebo RNA od 5'-konce k 3'-konci ♦ protein od N-konce k C-konci používají se jednopísmenové kódy dle pravidel IUPAC (tabulka) httD://orion.sci.muni.cz/kamb/bioinformat/sea samples.htm Příklady formátů sekvencí surová data - elektroforetogramy ve formátu *.abi, *.ab1 nebo *.scf ♦ prohlížeče Chromas, ABIView formát FASTA *.nt, *.aa nebo *.fa formát GenBank software pro převod formátů sekvencí, formátování a manipulaci s daty, např. SMS - The Sequence Manipulation Suitě v2 httD://w\ww.bioinfbrmatics.oro/sms2/ Nejčastější typy analýz sekvencí DNA Vyhledání otevřených čtecích rámců (ORF) Analýza využití kodonů Párové přiložení sekvencí, stanovení identity a podobnosti Vyhledání motivů v sekvencích Reštrikční analýza in silico Návrh sekvencí oligonukleotidů ■ primery pro PCR ■ primery pro sekvenování ■ hybridizační sondy Vyhledání otevřených čtecích rámců (ORF) ORF (Open Reading Frame) Sada překládaných kodonů mezi iniciačním a terminačním kodonem ORF Finder http://www.ncbi.nim.nih.aov/aorf/aorf.html ♦ Výsledek je závislý na použitém genetickém kódu ♦ U prokaryot, které nemají introny je základem hledání genů ♦ U eukaryot zpravidla využíváme analýzu sekvencí komplementární DNA (cDNA) Analýza využití kodonů (codon usage) Využití synonymních kodonů ♦ není náhodné ♦ je rozdílné u různých genomů, které mají určité preferované kodony pro určité aminokyseliny Databáze využití kodonů http://www.kazusa.or.iD/codon/ The Hurnan Codon Usage Table ! Cly I GGG ! 17.08 i 0.23 j Arg j AGG | 12.09 j 0.22 ! Trp ! TGG j 14.74 ! 1.00 j Arg j CGG 110.40 j 0.19 ! I Gly ! GGA ! 19.31 ! 0.26 I Arg | AGA | 11.73 | 0.21 I End I TGA I 2.64 I 0.61 | Arg ! COA ! 5.63 i 0.10 I ! Oly ! GGT i 13.66 ! 0.18 I 5er ! AGT j 10.18 ! 0.14 \ Cys I TG1 | 9.99 j 0.42 | Arg ! CGT j 5.16 i 0.09 | ! Oly j GGC 124.94 i 0.33 | 5er ! AGC 118.54 i 0.25 \ Cys I TGC I 1 3.85 I 0.58 | Arg j CGC j 10.S2 i 0.19 j ! Olu ! GAG i 38.82 j 0.59 I Lys ! AAG i 33.79 i 0.60 j End j TAG j 0.73 j 0.17 | Gin ! CAG j 32.95 i 0.73 | ! Olu i GAA 127.51 i 0.41 j Lys ! AAA i 22.32 | 0.40 | End | TAA j 0.95 j 0.22 | Gin ! CAA ! 11.94 i 0.27 | ! Asp ! GAT ! 21.45 j 0.44 I Asn j AAT j 15.43 j 0.44 I T^r ! TAT 111.80 I 0.42 j His j CAT j 9.56 i 0.41 I j Asp ! OAC ! 27.06 ! 0.56 I Asn j AAC 121.30 | 0.56 I Tyr I TAC 116.48 I 0.58 j His j CAC 114.00 i 0.59 I Nejčastější typy vyhledávání v sekvencích reštrikční místa repetice DNA ♦ přímé ♦ obrácené (vlásenky, vlásenky se smyčkou) konsenzní vzory uživatelsky definované vzory Reštrikční analýza in silico Reštrikční endonukleázy třídy II Sekvenčně specifické endonukleázy, které štěpí DNA v rozpoznávaných sekvencích Přehled dostupný v databázi REBASE- Restriction Enzyme Database http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html Sekvence rozpoznávacích míst Producent enzymu Reference Komerční dostupnost Sekvence genů Krystalografická data Citlivost k metylaci REBpredictor- predikce rozpoznávací sekvence u nových enzymů Rebase genomes - identifikace genů pro RE v genomech Software pro reštrikční mapování Konstrukce restrikčních map na základě analýzy sekvence DNA -vyhledání restrikčních míst Nezbytný předpoklad pro klonování Interpretace RFLP polymorfizmu Simulace výsledků gelové elektroforézy restrikčních fragmentů Virtuální klonování Vytvoření kvalitní grafiky ilustrující reštrikční mapy RestrictionMapper ( p://wwwjestrictionmapperora/) ♦ WebCutter( /www.firstmarketxom/cutter/cut2.htmh ♦ NEB Cutter v2.0 (fittp://tools.neb.com/NEBcutter2/) EMBOSS Restrict (http://bioweb.pasteur.fr/seaanal/interfaces/restrict.html) Restriction Maps (http://arbLcvmbs.colostate.edu/molkit/mapper/index.htmh pDRAW32 (rittp://www.acaclone.corri) Výsledky reštrikční analýzy in silico Enzymy, které sekvenci neštěpí Enzymy, které štěpí - počet a pozice rozpoznávacích míst Lineární nebo kružnicová mapa sekvence se znázorněním pozice restrikčních míst ♦ Grafika ♦ Identifikace ORF a translace do proteinu Klonování in silico, konstrukce vektorů Kombinace segmentů sekvencí ♦ známé/neznámé funkce j Plazmidy přebírané z databáze ♦ zpravidla známé funkce Inzerty - obvykle nové sekvence ♦ charakterizované reštrikční mapou ♦ charakterizované sekvencí DNA ♦ charakterizované funkcí Nomenklatura pro konstrukty není stanovena ^Vector NTI - [pBR322] \a\ File Edit View Molecule Analyse Gel DB List Tools Window Help - X ji^J _aj I I aMI I'M lajg^i _ □ S General L± DNA Plasmi ATCC 37017 length: 43 storage ty form: Giro □ iii Function CDS (3 b Miscfd Promote RBS [2 if m m m m □i [ 151 CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT GCGGGATATC GTCCATTCCl ^ GAACCAATAC GGCCATGACG GCCCGGAGAA CGCCCTATAG CAGGTAAGGT 201 251 ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA TGCGTTGATG TGTCGTAGCG GTCAGTGATA CCGCACGACG ATCGCGATAT ACGCAACTAC CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC GCTTTGGCCG Ready 200 bp-1200 bp 1201 bp [2£ Navrhování sekvencí primerů ■ Polymerázová řetězová reakce ■ Modifikované oligonukleotidy na 5'-konci pro klonování ■ Oligonukleotidy jako hybridizační sondy pro realtime PCR Syntéza obou řetězců u specifické sekvence Přímý (forward) 5' primer 3' TTGAGAAAGGAATAAGC - +- - T C T T TAGC T C AT AT AC G 3' 5' Zpětný (reverse) primer 5' 3' T T GAGAAAGGAAT AAGC AGAAT T C GT T C C AAAAAGAAT GAGC TGTTGTTT GC AGAAAT C GAGT AT AT GC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3' 5' Design primem pro PCR Relativně snadná výpočetní záležitost -prohledávání sekvence a identifikace krátkých sekvencí splňujících určitá kritéria Délka primem Obsah G+C Teplota Tm Specificita Komplementarita příměrových sekvencí Sekvence 3'-konce Jedinečnost primem ■ Na jedinečnost primem a jeho hybridizační vlastnosti (annealing) má vliv délka primem a velikost templátové DNA ♦ Délka (17 - 28 bází dlouhé) ■ Možná hybridizační místa primem by se také neměla nacházet na DNA tvořících případné kontaminace vzorků DU5W109X 0VID9JDWOL9V3 IDOL V Primer 1 5' -TGCTAAGTTG-3' Není jedinečný! Primer 2 5' -CAGTCAACTGCTAC-3' Jedinečný! Zastoupení bází Zastoupení bází ovlivňuje vlastnosti hybridizace a reasociace primem Žádoucí je náhodná distribuce bází bez oblastí bohatých na AT nebo GC Obvyklý obsah G+C, který poskytuje stabilní hybridy je 40-60 %, ale závisí také na obsahu G+C templátu ♦ mají Tm teplotu 50 - 65 °C T = 0,3 x 7Primer+ 0,7 x rProdukt - 25 a ' m > m kde 7m Primer je hodnota Tm nejméně stabilního páru primer-matrice a 7"m Produkt je hodnota Tm amplifikačního produktu. Orientačně lze vypočítat Ta podle vztahu: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) 7-a=7-m-5°C nejsou komplementární navzájem na 3'-koncích, takže nevytvářejí navzájem nebo samy se sebou duplexy neobsahují vnitřní sekundární struktury Chybně navržená dvojice primem, která vytváří stabilní duplex na 3'-konci: 5, ;vrTCAACCGTTCAAACAAGCCC 3' 3' GTTCGGCCTACCTTTATTTCTC 5' Správně navržená dvojice primem, která vytváří pouze málo stabilní duplex na 5'-konci; na 3'-konci je G nebo C zaručující stabilní párování s templátem: 5' CGAAATAAGACTAGTAAAGC 3' I I I I I I I 3' CCTTACTCCACGCCTAATACAATCC 5' ♦ Chybně navržený primer, vytvářející vlásenku: 51 TTTTTCAAGG-III C 3' AAAAGAGAT-" Hairpin 3* GGGAAA->, I I I I 5' TATCTAGGACCTTA—^ 3' GGGAA"^ II I * 5' TATCTAGGACCTTA-J Self-Dimer S top 3' GGGAAAATTC C AGGATC TAT 5' I I I I I I I I 5 1 TATCTAGGACCTTAAAAGGG 3 1 4 top 31 GGGAAAATTC C AGGATC TAT 51 I I I I 51 TATCTAGGACCTTAAAAGGG 3 1 Dimer forward primer 5' TATCTAGGACCTTAAAAGGG 3' I I I I I 3' C ATGGAAAC G TAGGAGAC 5' reverse primer ♦ na matricové DNA nemají falešná vazebná místa Nesprávně navržený primer s falešnými vazebnými místy 029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1 048); II I I I I I I I I III 3'(948) tttcttacccttttt-tacc (966)5' i i 'i ' r^n a 5'(1 029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1 048)3' na templatove DNA: ............. 5'(1 029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1 048)3' II II I II MIMI 3'(1191) tttgtattgcattatatacc (1210)5' 5'(1 029) AAG G C TAGAG AAAAAT AT G G (1 048)3' I I I I I I I I I I I I 3'(395) tccatttttctttttatctt (414)5' Správně navržený primer, který nemá falešná vazebná místa na templátu: 5Y2476) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2452)3' I I I I I I I I III 3'(787) taaatctattagttt acacataacc (811)5' 5Y2476) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2452)3' I I I I I I I I I I 3'(3211) caattgt aact at aactgcgttatc (3235)5' 5'(2476) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2452)3' I I I I I I I I I I 3'(1194) gtattgcattatat acctctgttag (1218)5' 5Y2476) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2452)3' I I I I I I I I II I 3'(1469) atattgta-tatacgaactaaatct (1492)5' Kdy je primer ještě primerem? Pro návrh primem se obvykle používá specializovaný software Dot display mode Bar graph mode Lower Primer False Priming Sites MI3MP18 HB Lover Primer - M13MP18 6310L19 (positive strand) Priming efficiency of the perfect match is 428 (above the threshold) Priming efficiency : 428 (above the threshold) 5'(6328) GGTTTTCCCflGTCflCGRCG (6310)3' I I I I M I I I M I I I I I I I 3'(6328) ccaaaagggtcagtgctgc (6310)5' Priming efficiency : 205 (above the threshold) 5 (6328) GGTTTTCCCflGTCflCGRCG (6310)3* III I I I I IIIIII 3*(626) agcaaatggtc—tgctgc (610)5* Priming efficiency : 194 (above the threshold) 5(6328) GGTTTTCCCflGTCflCGRCG (6310)3' II I lllllll I I I I 3*(808) gtaatatggtcagtcctgc (790)5* Priming efficiency : 185 (above the threshold) 5 (6328) GGTTTTCCCflGTCflCGRCG (6310)3' % I II llllllll III , 3'(5I25) tctaagtggtcagtg-tgc (5108)5' Priming efficiency : 121 5(6328) GGTTTTC-CCRGTCflCGRCG (6310)3* , I I I I I I I I I I I I I I 3'(5989) agaaaagtggtc-gctctgc (5971)5' Lover Primer - Ml 3MP18 631OL19 (negative strand) Priming efficiency of the perfect match is 428 (above the threshold) Priming efficiency : 76 5'(6328) GGTTTTCCCflGTCflCGRCG (6310)3' 3'(5744) ccaaaaagcgggaaactgc (5762)5" I Current Olino i pCBluŠ.seq Sequence Length: 1842 Current Oligo (+ strand) 5' CCCGCCTG ATG A ATGCTC ATC 3' Length: 21-mer 5' Position: Tm: AG (25 °C): Degeneracy: P.E.*: 1373 72.1 °C -42.7 kcal/m 492 5.30 nmol/A260 34.0 /íg/A2Ě0 Current Oligo (- strand) 5' G ATG AGC ATTC ATC AGGCGGG 3' P.E.*: 537 4.SO nmol/A260 31 .7 rg/A2Ě0 1/E: 1 Selected Primers 1 pCBIu3.seq pCBIu3:269U21 Upper Primer 5' CGGCGCC AG ATCTGGT ACCC A 3' Length: 21-mer 5" Position: 269 Tm: 76.9 °C AG (25 *C): -46.1 kcal/mol Degeneracy: 1 P.E.* 1/E: 542/542 5.12 nmol/A260 33.1 /ig/A260 pCBIu3:817L21 Lover Primer 5' T ACCGGGTTGG ACTC A AG ACG 3' Length: 21-mer 3" Position: S17 AG (25 °C): Degeneracy: P.E.*: 69.5 °C -41.4 kcal/m 502/502 4.S9 nmol/A260 32.0 rg/A260 PCR pCBlu.seq" Optimal Annealing Temperature: 58.3° (Max: 72.0°) Position and Length Tm ra GC [95] P.E.« Product 1352 88.0 51.3 Upper Primer 37 21 72.2 47.6 452 Lover Primer 1368 21 79.9 57.1 506 Product Tm - Upper Primer Tjy Primers Tm difference: 15.8 7.6 Concentration Upper Primer 200.0 nM Lover Primer 200 0 nfl Monovalent Cation 50.0 mM Free Mg[2+] 0.7 mM Terminal stability of the Lower Primer is too high. Total Na[+] Equivalent: 155.8 Počítačový návrh primem Umoňuje řada molekulárně biologických programů Některé jsou volně dostupné na internetu GCG Primer3 OligoExplorer BioTools WebPrimer PrimerBlast Kalkulátory vlastností primerů Oligo Analyzer fhttp://eu,idtdna.com/SciTools/SciTools.aspx?cat=DesianAnalvze) BioMath ( /www>promeaa.corn/biomath/calc11 .htm) Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm) Primer3 Input (version 0.4.0) - MoziMa Firefox Soubor Úpravy Zobrazení Historie Záložky Nástroje Nápověda - □ T C X ^ (\V http://rroďo" . wi. mit. edu/primer3/input. htm " £1" Google \V PrimeľS Input (version 0.4.0) PrimGr3 (v. 0.4.0) Pick primers from a DNA sequence. Checks for mispriming in template. disclaimer Priiner3 Home Printer3i>ms interface cautions FAQ/WIKI Paste source sequence below (5'->3', string of ACGTNacgtn -- other letters treated as N -- numbers and blanks ignored). FASTA format ok. Please N-out undesirable sequence (vector, ALUs, LLNEs, etc.) or use a Misprirning Library (repeat library): NONE >SA44Kta001 [org=Staphylococcus aureus] [strain=CCM 885] [clone = 7/IV] Staphylococcus aureuss j EcoRI-clone from common 44 kin Smal fragment gaattcaaaaccagcaaaagctgtgaaaaagccattaccaagtaaagataatttggctatattgtatggagaaggatttcatatttgtaaaggcgI aattatttggaaaacatcgacatggtgaagattgtctgttctgtttagaagttttaagtgattaatcaagcacactcaaatagtgttataattat aaatgaatatggtttggataagtctgagacaatgcatgtttcaggctttaattgtgtataaagttttggtgattgcataagagatggcggtacta aatgttattattaagtgtgcacgcagtatcattagttataaaatgtagctgttaaaagtcaaaaatacatcgaatgtagttaggcatataatataQ fib ]0 0 Pick left primer, or use left primer below: D Pick hybridization probe (internal oligo), or use oligo below: 0 Pick right primer, or use right primer below (5' to 3' on opposite strand): Pick Primers Reset Form Sequence Id: Targets: Hotovo A string to identify your output. E.g. 50,2 requires primers to simuum, [ and ]: e.g. ...ATCT[CCCC]TCAT.. E.g. 50,2 requires primers to surround the 2 bases at positions 50 and 51. Or mark the source sequence with . U1C £ □cllCS 0.1 positions JU dllU. Jl. IlldllL uic i means that primers must flank the central CCCC. @Primer3 Input (version 0.4.0) - Mozilla Firefox Soubor Úpravy Zobrazení Historie Záložky Nástroje Nápověda T C X ítí (W http://rrodo .iwi.ľinit.edu/priľiner3/input.htrin Ô T £IT Google P W Primer3 Input (version 0.4.0) Pick Primers Reset Form Sequence Id: Targets: Excluded Regions: Product Size Ranges A string to identify your output. E.g. 50,2 requires primers to surround the 2 bases at positions 50 and 51. Or mark the source sequence with [ and ]: e.g. ...ATCT[CCCC]TCAT. means that primers must flank the central CCCC. E.g. 401,7 68,3 forbids selection of primers in the 7 bases starting at 401 and the 3 bases at 68. Or mark the source sequence with < and >: e.g. ...ATCTTCAT.. forbids primers in the central CCCC. 150-250 1 00-300 301-400 401-500 501-600 601-700 701-850 851-1 000 Number To Return Max Repeat Misprirning Max Template Misprirning Max 3' Stability 9.0 12.00 Pair Max Repeat Misprirning 24.00 12.00 Pair Max Template Msprirning 24.00 Pick Primers Reset Form General Primer Picking Conditions Primer Size Min: Primer Tm Min: Product Tm Min: Primer GC% Min: Hotovo 57.0 20.0 Opt: Opt: Opt: Opt: 20 60.0 Max: Max: Max: Max: 27 63.0 Max Tm Difference: 100.0 Table of thermodynamic parameters: Breslauer et al. 1906 v] 80.0 Primer3 Output (p rime r3_resu Its. cgi release 0.4.0) - Mozilla Firefox 5oubor Úpravy Zobrazení Historie Záložky Nástroje Nápověda T C X ťfr (\V http://frodo" ,wi,mit,edu/cgi-bin/primer3-web-cgi-bin-0,4,0/prirner3_results,cgi ^ T {|' Google ý PRIMER PICKING RESULTS FOR SA44kfciÜÜl [ücg=StaphylüCüccus aureus] [stuain=CCM 885] [clone=7/IV] Staphylococcus aure No niispuiniing library specified Using 1-based sequence positions OLIGO staut len tin gc% any 3' seq LEFT PRIMER 159 2 5 57.21 32.00 6.00 2.00 AATCAAGCACACTCAAATAGTGTTA RIGHT PRIMER 42 9 2 5 58.40 36.00 4.00 3.00 AACTCCTATGAAGACAACCTTTTTC SEQUENCE SIZE: 2052 INCLUDED REGION SIZE: 2052 PRODUCT SIZE: 271, PAIR ANY COMPL: 5.ÜÜ, PAIR 3' COMPL: 3.00 TARGETS (start, len)*: 2ÜÜ,2ÜÜ 1 GAATTCAAAACCAGCAAAAGCTGTGAAAAAGCCATTACCAAGTAAAGATAATTTGGCTAT 61 ATTGTATGGAGAAGGATTTCATATTTGTAAAGGCGAATTATTTGGAAAACATCGACATGG 121 TGAAGATTGTCTGTTCTGTTTAGAAGTTTTAAGTGATTAATCAAGCACACTCAAATAGTG >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> 181 TTATAATTATAAATGAATATGGTTTGGATAAGTCTGAGACAATGCATGTTTCAGGCTTTA >>> ***************************************** 241 ATTGTGTATAAAGTTTTGGTGATTGCATAAGAGATGGCGGTACTAAATGTTATTATTAAG ************************************************************ 301 TGTGCACGCAGTATCATTAGTTATAAAATGTAGCTGTTAAAAGTCAAAAATACATCGAAT ************************************************************ 3 61 GTAGTTAGGCATATAATATAAAAAGAGTTTTCAATTACTCAATAGAAAAAGGTTGTCTTC *************************************** <<<<<<<<<<<<<<<< <1 m, I___\y\ Hotovo Oligo J>J Oligo 7 Demo - Human elF-4E.seq File Edit Analyze Search Se[ect Change View Window Help ms ad & Seq uence File: Human elF-4E.seq DNA Sequence Sequence Length: 1868 nt Reading Frame: +1 Current Oligo Length: 21 nt Position: 956 H> W 49.1°C Selected Oligo Position Length Hi S Forward Primer 997 22 SB □ Reverse Primer 1061 21 m □ Upper Oligo 956 21 0 Lower Oligo — — m PCR Product [85,—] nt Feature Location -18..1850 joo ,jso ,400 ,4so ,soo ,sso ,eoo ,«o .too ,T£0 300 ,950 ,1000 ,1050 ,1100 ,1150 ,1200 ,12S0 ,1300 ,1JS0 ,1400 ,1440 ,1500 ,1SS0 ,1600 ,1640 ,1700 ,1750 ,1300 I =■=■-' >.■•.:• || r| rru ||i7-^ | =■=■-■ | iuuu | iltu | i i| i i?j | iji>.>j | im | pos: tm: ,950 ,960 ,970 ,980 ,990 ,1000 ,1010 ,1020 ,1030 ,1040 ,1050 ,1060 ,1070 ,1030 ......'.........i.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........'..... TGGCATTTCTATACTTTACAGG.............................. ACATACAGATTTTACCTATCC......................... ATTAC C ATTAATTAC ATAC AGATTTTAC CTATC C AC AATAGTC AGAAAACAACTTGGC ATTTCTATACTTTAC AGGAAAAAAMTTCTGTTGTTCCATTTTAT&CAGMGCATATTTTGCT>TTGAAAGATTATGATGCAT TAATGGTAATTAATGTATGTCTAAAATGGATAGGTGTTATCAGTCTTTTGTTGAAC C GTAAAGATATGAAATGTC CTTTTTTTTAAGACAACAAGGTAAAATAC GTCTTCGTATAAAAC GAC CAAACTTTCTAATACTAC GTJi C GAC C AAACTTTCTAATACTA ITINYIQILPIHHSQKTTUHFYTLQEKKFCCSILCRSIFCWFERL-CI peady.. [> Výsledky Výběr optimálního páru primem Sekvence primem Délka primem a hodnota Tm Velikost produktu Posouzení sekundárních struktur Podmínky reakce Alternativní primery Pokročilý návrh primem ■ Alelově specifické primery ■ Molekulární diagnostika ■ Vícenásobné detekce - primery pro multiplex PCR ♦ Zajištění kompatibility primem v reakci ■ Konsenzní primery ♦ Pro klonování ♦ Pro PCR-RFLP (např. 16S rRNA) ♦ Vyžaduje identifikaci konzervativních oblastí na základě mnohonásobných přiložení sekvencí (multiple alignment) ■ Primery pro modifikaci konců produktů PCR Modifikace konců DNA, Připojení sekvencí prostřednictvím 5'-konců primem 5' 3' 5' 5' 3'- Cílová sekvence 3' 5' Denaturace 1 a připojení primerů 1 a 2 Primer 1 GCGCAAGc H/ndlll 5' gcgcaIagctt 3 CGCGTTCGAA l PCR Target region 31 C7TAAGCCGG 5' Primer 2 5' Eco Rl 3AATTCGGCC CTTAAGCCGG „sticky foot" Přidávané sekvence ♦ RE místa Promotory ♦ Terminátory Translační signály Další technologie vyžadující návrh oligonukleotidů Real-time PCR ♦ TaqMan ♦ Molecular Beacons Primer extension Sekvenování ♦ Sangerovo sekvenování ♦ Pyrosekvenování Ligázová řetězová reakce Oligonukleotidy pro microarrays