Sekvencování DNA • stanovení pořadí nukleotidů v molekule DNA (primární struktury) Sekvencování / Sekvenování ?? Sequencing / die Sequenzierung / - Techniky sekvencování • 2 klasické metody: – Chemická (Maxamova-Gilbertova) • Již se nepoužívá – Enzymová (Sangerova) • V současnosti se používá automatická varianta – společný rys obou metod: příprava a separace fragmentů DNA, jejichž velikost se liší o 1 nukleotid • Několik nových vysoce účinných metod (Pyrosekvencování, SOLiD, Solexa, aj.) v Příprava knihovny pro sekvencování - DNA s přesně definovanými konci • s místem pro vazbu primeru • s koncovou značkou v Příprava souboru všech fragmentů ssDNA lišících se svou délkou o jeden nukleotid v Přesné elektroforetické rozdělení těchto fragmentů na základě jejich délky Základní požadavky pro úspěšné stanovení sekvence: Postup enzymatického sekvencování DNA 1. Příprava ssDNA jejíž sekvence má být stanovena 2. Rozdělení do 4 vzorků 3. Reakce s DNA polymerázou při níž se začlení do syntetizované DNA místo normálního deoxyribonukleosidtrifosfátu jeho analog, který působí jako koncový inhibitor syntézy DNA - dideoxynukleosidtrifosfát (ddNTP). V každém ze 4 vzorků vzniknou fragmenty, které jsou zakončeny příslušným ddNTP (ddCTP, ddGTP, ddATP a ddTTP). Reakce obsahuje: •molekulu DNA •značený primer při pojující se k části molekuly DNA (místo odkud začínáme stanovovat sekvenci) •směs obsahující 4 normální nukleotidy •jeden ddNTP (v každém ze 4 vzorků je jiný) •DNA polymerázu 4. Denaturace produktů 5. Elektroforetická separace umožňující oddělení fragmentů lišících se délkou o jednu bázi 6. Detekce fragmentů, které nesou označený konec Dideoxynukleotidy nemají hydroxyl na 3’-konci Pokud je dideoxynukleotid inkorporován do syntetizujícího se řetězce, působí jako terminátor reakce Původní sekvence Denaturovaný templátový řetězec Prfektní kopie 3’ 5’ Replikace DNA s normálními deoxynukleotidy Co se stane pokud při reakci použijete směs dGTP a ddGTP? Původní sekvence Templátový řetězec Perfektní kopie 3’ 5’ Směs řetězců ukončených GUANINEM při použití směsi dGTP a ddGTP Enzymová metoda sekvencování DNA (Sanger) DNASequencing.mov seq4.mov Automatické sekvencování DNA • Je variantou enzymatického sekvencování DNA. • Syntéza DNA probíhá v jedné reakci • Ke značení produktů se používají čtyřmi různými fluorescenčními značkami označené • primery • dideoxyribonukleotidy Asymetrická PCR pro sekvencování Strategie barevných primerů Strategie barevných terminátorů GEL + _ LASER DETEKTOR Princip detekce produktů Fragmenty • Detekce produktů probíhá během elektroforézy pomocí laserového detektoru (laserem indukovaná fluorescence, LIF) napojeného na počítač, který vyhodnocuje sekvenci. BARVY: - AMIDITOVÉ filtr žebříček HEX (černá) 6-FAM (modrá) C TAMRA TET (zelená) - ESTEROVÉ TAMRA (černá) JOE (zelená) A ROX 5-FAM (modrá) Příklad fluorescenčního znační primerů Genetický analyzátor ABI 3100 Laserový detektor Příprava gelu Rezervoár pufru Automatické nanášení vzorku Soustava kapilár Vyhřívaná deska Příklad výstupu 1 dráha na gelu Sekvencování genomů V praxi je velice často potřeba stanovit sekvenci fragmentu DNA, který je delší než průměrná délka 500 – 1 000 bází dosahovaná v jedné reakci. K tomuto účelu sekvencování genomů mohou být zvoleny dvě zcela odlišné strategie: – náhodné sekvencování – uspořádané sekvencování sousedních úseků Příprava knihovny pro náhodné sekvencování genomů • Při náhodném sekvencování genomu jsou nejdříve připraveny mechanickým stříháním genomové DNA fragmenty s optimální velikostí (1 300 – 2 000 bp) a po úpravě jejich konců jsou nahodile naklonovány do vhodného vektoru za vzniku velkého počtu klonů. • Ke štěpení DNA se využívá sonikace nebo pankreatická DNáza I za přítomnosti Mn2+. • Předpokládá se, že celková informace o sekvenci obsažená v připravených malých klonech odpovídá původní DNA a sekvence fragmentů jednotlivých klonů se vzájemně překrývají. • Pomocí univerzálních sekvenačních primerů připojujících se k vektoru poblíž klonovacího místa jsou stanoveny sekvence krátkých úseků na koncích klonovaných fragmentů (minimálně 500 bází). • Stanovené sekvence jsou pak použity k uspořádání klonovaných fragmentů z jednotlivých vektorů do souvislých sekvencí genomové DNA - kontigů. Fragmentace Izolace DNA + Úprava konců a klonováníVektor Sestavení překrývajících se klonů Náhodné sekvencování Nepokryté konce Pouze 1 řetězec OBJASNĚNÍ NESHOD T T C USPOŘÁDANÉ SEKVENCOVÁNÍ – Pro doplnění sekvence mezer zbývajících po náhodném sekvencování – Pro sekvencování malých fragmentů DNA • Dva odlišné přístupy: – procházení primerem • vyžaduje znalost sekvence, ke které se připojuje primer, který umožní prodloužení řetězce DNA-polymerázou. • získaná sekvence z první reakce je použita pro návrh primeru pro další reakci a tento krok se opakuje, dokud není dosaženo kompletního stanovení sekvence. • Tento proces nevyžaduje další klonování a minimalizuje stanovení nadbytečných sekvencí, ale správnost stanovené sekvence by měla být ověřena sekvencováním obou řetězců. – postupné zkracování fragmentu exonukleázou a tvorba sousedících delecí Metody uspořádaného sekvencování Procházení primerem Sousední delece DOKONČENÍ PROJEKTU • Sestavení kontigů • Anotace (bioinformatika): ORF, repetice, regulační oblasti, geny,  funkce Nové přístupy pro stanovení sekvence DNA • Pyrosekvencování (454 sekvencování) • SOLiD • Solexa • Komparativní genomové sekvencování prostřednictvím hybridizace Pyrosekvencování • Sekvencování se syntézou DNA v reálném čase nevyžadující elektroforézu ani separaci fragmentů • Je založené na uvolnění pyrofosfátu (PPi) při enzamatické syntéze DNA (Nyren et al., 1987) • 1. krok: Sekvenační primer hybridizuje k jednořetězcovému templátu a je inkubován s: • DNA polymerázou • ATP sulfurylázou • Luciferázou • Apyrázou • substrátem, adenozin 5´-fosfosulfátem (APS) • luciferinem • 2. krok: První ze 4 dNTP – dATP je přidán k reakci – Pokud je na matrici komplementární báze, DNA polymeráza katalyzuje připojení nukleotidu k primeru – Pokud na matrici není komplementární báze nukleotid bude degradován apyrázou – Postupně budou přidány jeden po druhém všechny čtyři dNTP – Každé připojení nukleotidu je provázeno uvolněním pyrofosfátu (PPi) v množství ekvimolárním množství přidaného nukleotidu • 3. krok: ATP sulfuryláza kvantitativně přeměňuje PPi na ATP za přítomnosti APS – Vzniklý ATP umožní luciferázou zprostředkovanou konverzi luciferinu na oxyluciferin, který vytvoří světelný záblesk zaznamenaný detektorem fotonů a zobrazený jako pík na pyrogramu • 4. krok: Apyráza degraduje nepřipojené dNTP a nespotřebované ATP – Až je degradace kompletní je přidán další dNTP, který je v pořadí • Proces se znovu opakuje a sekvence je odečítána z pyrogramu • Namísto standardního dATP je používán a-thiosubstituovaný dATP, který je přijímán DNA polymerázou, ale nikoli luciferázou • Metoda je ve vývoji a je používána pro identifikaci jednonukleotidových polymorfizmů (SNPs) Princip pyrosekvencování pyrogram Pyrosekvencování (GS20 firmy 454 Life Sciences, rok 2005) Výhody • Vysoká přesnost • Flexibilita a možnost paralelního zpracování velkého množství vzorků • Snadná automatizace • Nevyžaduje elektroforézu a značené primery Nevýhody • Rychlost pyrosekvencování je cca 1 odečtená báze/min. • Maximální délka stanovené sekvence je cca 100 bp • 0,3 Gbp za týden Současná technologie pyrosekvencování • Příprava jednořetězcové DNA knihovny – Umožňuje zpracovat různé typy vzorků • genomové DNA • produkty PCR • BACs • cDNA – Frakcionace dlouhých úseků na 300- to 800-bp fragmenty – Vazba dvou adaptorů A a B – specifických pro 3’- a 5’-konce na každý fragment • Adaptor A obsahuje vazebné místo pro primer • Adaptor B B obsahuje 5'-biotinovou značku, která slouží k imobilizaci DNA knihovny na mikrosféry (DNA Capture Beads) pokryté streptavidinem Současná technologie pyrosekvencování – Separace kuliček a výběr pouze těch, které obsahují navázaný jediný fragment ssDNA • Klonální amplifikace knihovny v emulzi – emulzní PCR, amplifikační reagencie ve směsi voda-olej mikroreaktory obsahující jedinou kuličku s unikátním fragmentem DNA z knihovny - (107) kopií • Pyrosekvencování • Analýza dat s využitím bioinformatických nástrojů Sekvenátor FLX firmy Roche • Pyrosekvencování (One Bead = One Read) Kuličky se z emulze extrahují a jsou umístěny pomocí centrifugace do PicoTiterPlate, čipu z optických vláken o rozměrech 70 × 75 mm – Průměr jamek PicoTiterPlate dovoluje umístění pouze jedné kuličky průměru 28 mm • Na jednom čipu je 1 600 000 jamek – Převrstvení směsí obsahující reagencie pro pyrosekvencování, enzymy jsou rovněž imobilizovány na malých mikrosférách • Spodní část čipu je v optickém kontaktu s dalšími optickými vlákny napojenými na CCD senzor - zachycení až 10000 emitovaných fotonů na 1 nukleotid Sekvenátor FLX firmy Roche • Kombinace vysoké intenzity signálu a pozičně specifické informace na mikrodestičce umožňuje současně analyzovat více než 1 milion sekvenačních běhů za 10 hod. – Délka stanovené sekvence 400 bp – Stanovení až 400 Mbp de novo – Resekvenace genomů jakékoli velikosti • Limitující faktory – Negativní posuny čtecího rámce • 3'→5' exonukleázová aktivita DNA polymerázy • homopolymerní úseky – Pozitivní posuny čtecího rámce • Nedostatečná enzymatická aktivitá apyrázy – Přesnost 99,5 % na prvních 250 bp Současné možnosti pyrosekvencování • Paralelní analýza více vzorků – Adaptory obsahující sekvence MID (Multiplex Identifiers) • Až 12 různých unikátních sekvencí • Přidány během přípravy knihovny • Koamplifikovány s fragmenty DNA – Rozdělení mikrodestičky do 2, 4, 8 nebo 16 menších oblastí • Zabránění vzájemné kontaminace vzorků – Možnost sekvenovat současně až 192 různých vzorků DNA