1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Luděk Bláha, PřF MU Účinky toxických látek 1 - molekulární / buněčné mechanismy - OPVK_MU_stred_2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif TOXIKODYNAMIKA - základní principy - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Vztah mezi toxikokinetikou a toxikodynamikou 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Toxikodynamika vychází z propracované „farmakodynamiky“ a přejímá její koncepty popisuje procesy na molekulární úrovni V místě kontaktu toxikantu s cílovým místem („receptorem“) dochází k interakci toxikant-receptor Interakce mezi dvěma chemickými látkami Cílové struktury = základní makromolekuly: Proteiny STRUKTURNÍ (tubulin apod.) ENZYMY TRANSPORTÉRY (v membráně, hemoglobin) PROTEINOVÉ RECEPTORY (v membráně i v cytoplasmě) Nukleové kyseliny Fosfolipidy (Sacharidy) http://www.orko.cz/Varia/Pro%20Katku/Campbell%20obr%E1zky/07_Art_for_Students/07_09-MembProteinFunc tion-L.jpg Ilustrace –příklady funkcí proteinů (jen membránové) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://www.nc3rs.org.uk/downloaddoc.asp?id=744 Interakce látek s proteiny: klíčové procesy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce toxických látek s receptory - interakce pozitivní à indukce odpovědi (agonista) (nahrazuje efekt ligandu, mimic effect, hormone-like effect) - interakce negativní à kompetice: nevyvolává reakci (antagonista) (blokuje navázání a efekt přirozeného ligandu, př. anti/estrogenita) HORMONE EFFECT TOXIN HORMONE EFFECT TOXIN 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady cílových struktur (receptor = jakákoliv biomolekula, kterou může ovlivnit toxikant) - buněčná membrána narkotická toxicita - dosažení takové koncentrace, že dochází k blokaci fluidity membrány a tím její funkce - acetylcholinesteráza enzym - inhibice v aktivním místě organofosfátovými pesticidy (substrate mimics) - Arylhydrocarbon receptor (AhR), estrogenní receptor (ER) specifické mechanismy toxicity, xenoestrogenity - další …. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Typy interakcí („vazby“) mezi toxikantem a receptorem -nekovalentní (viz příklad na následujícím snímku) vodíkové můstky hydrofobní interakce iontové interakce van der Waalsovy interakce (reverzibilní) -kovalentní - inhibice acetylcholinesterázy organofosfátem... - vazba látky na DNA (zpravidla ireverzibilní) http://www.bioscience.org/2008/v13/af/3175/fig10.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Typy interakcí mezi látkami (příklad – interakce mezi proteiny) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Rychlost a síla interakce závisí na: - koncentraci obou interagujících látek (určující je zpravidla koncentrace toxikantu - ta je dána toxokinetikou) à AFINITA vazby „ligand-receptor“ : Hodnocení - disociační konstanty: Kd (pro účinné látky cca v rozmezí 10-8 M až 10-3 M) (koncentrace která stačí k navázání z 50% na příslušný receptor) Afinita - vyjadřuje se často jako převrácená hodnota (1/Kd) à Toxicita (efekt) je pak dán schopností ÚČINNOSTÍ (efficacy) látky vyvolat příslušný efekt Rychlost a síla interakce http://www.blobs.org/science/cells/affinity.gif http://www.blobs.org/science/cells/efficacy.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Jedná látka může reagovat s více receptory !!! Která interakce bude preferována (která se projeví toxicky) ? Významné faktory Koncentrace vs. rychlost toxického projevu interakce dioxin: vysoké dávky à akutní chlorakne, smrt, nízké dávky, dlouhodobě à karcinogenita, imunosuprese … Prostorové umístění a kontakt s receptory embryo vs. dospělec insekticid: vysoká dávka - akutní toxicita -> žábry / smrt nízká dávka je distribuována v těle a působí chronicky -> imunotoxicita Kd - jednotlivých interakcí organofosfát: specifická inhibice AcChE, velmi nízké Kd à specifické působení TOXIKODYNAMIKA - základní principy - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Látka může reagovat s více receptory !!! Příklad - 2,3,7,8-TCDD - indukce AhR (thymus, játra Kd 10-12 - 10-15 M) -> nádor/měsíce – roky (karcinogenita, imunotoxicita) - indukce estrogenity (pohlavní orgány Kd 10-9 - 10-12 M) -> reprodukční poruchy/měsíce - roky - narkotická toxicita (10-6 M) -> akutní rychlá intoxikace TOXIKODYNAMIKA - základní principy - dioxiny 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Akutní (!) toxicita TCDD a ostatních látek (potkan LD50 mg/kg ž.v.) Chemical LD 50 Value (mg/kg ž.v.) TCDD (a form of dioxin) 0.01 Tetrodotoxin (globefish toxin) 0.01 Saxitoxin (shellfish poison) 0.8 Carbofuran (a pesticide) 10 Phosphamidon (an insecticide) 24 Nicotine 50 Caffeine 200 DDT (an insecticide) 200 2,4–D (an herbicide) 370 Mirex (an insecticide) 740 Acetylsalicylic acid (aspirin) 1,700 Malathion (an insecticide) 2,000 Sodium chloride (table salt) 3,750 Glyphosate (an herbicide) 4,300 Ethanol (drinking alcohol) 13,700 Sucrose (table sugar) 30,000 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Jaké makromolekuly jsou cílem toxických látek? Jaké existují interakce mezi toxickými látkami a makromolekulami? Jaký typ intereakce bude nejpravděpodobnější mezi * hexachlorhexanem … a hemoglobinem? …a fosfolipidem? * formaldehydem … a tubulinem? … a nukleovou kyselinou? Co je to toxikodynamická disociační konstanta? Ke které makromolekule má TCDD vyšší afinitu? U které interakce bude vyšší Kd? K receptoru AhR nebo k hemoglobinu? Co je agonista? Co je antagonista? Toxikodynamika - otázky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Účinky látek na molekulární úrovni: mechanismy působení 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Co by si student(ka) měl(a) odnést ? 1)ZNÁT a dokázat vysvětlit hlavní Molekulární a Biochemické mechanismy toxicity 2) 2) 2)Dokázat přiřadit ke každému mechanismu toxicity některé z významných environmentálních toxikantů 3) 3) 3)Vysvětlit, jak se jednotlivé BIOCHEMICKÉ MECHANISMY toxicity projeví na vyšších úrovních (příklad – inhibice receptoru pro hormon à projev: porušení reprodukce) 4) 4) 4) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Připomenutí: mechanistický koncept od molekuly k populacím (V literatuře: „Adverse Outcome Pathway“) http://u.jimdo.com/www32/o/s09b2938cc0a6d68f/img/iea0bcf86690428e0/1328014089/orig/models-for-ecoto xicology-and-risk-assessment-toxicokinetics-are-what-the-organism-does-with-the-chemical-and-toxico dynamics-are-what-the-chemical-does-to-the-organism.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Základní typy ekotoxicity organických látek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Membránová toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Narušení membrány - základní toxicita (baseline toxicity) = narkoza (narcosis) (nejde o narkozu farmakologickou, kde se uvažuje velmi specifické působení na receptory na membránách) - Zásadní význam v ekotoxicitě většiny organických polutantů - efekty závislé na HYDROFOBICITĚ (Kow / logP) - při vyšších koncentracích akumulace látek v membránách à narušení zásadních životních funkcí (přenos nervových signálů, tvorba ATP atd atd) Mechanismus 1: Interakce s membránou 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Poznámka: cholesterol - strukturně „velikostí“ obdobný jako jiné organické látky (PAHs, neutrální toxikanty…) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Narkotická (membránová toxicita) à důsledky a projevy AKUTNÍ EKOTOXICITA Přímá korelace mezi logP a EC50 u vodních organismů (Daphnia, ryby, planktonní řasy …) Obrázek: Neutrální organické látky à Nepolární narkoza Aminy, fenoly à Polární narkoza (při stejném logP je pozorována vyšší toxicita – tj. vyšší hodnoty 1/EC50 než u neutrálních látek) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Mutagenita a genotoxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif DNA - klíčová molekula života - pečlivá kontrola struktury (a funkce) DNA všech organismů často mutuje: - základ přirozené variability, adaptací, evoluce Naprostá většina případných mutací je opravena Neopravitelné změny à 99.9% řízená smrt buňky (apoptoza) à minimum změn zůstane zachováno à projevy (adaptace, evoluce … genotoxicita) - Mutagenita a genotoxicita - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif - Mutagenita a genotoxicita - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Chemické látky mohou indukovat poškození DNA mutageny = látky způsobující mutace (změny/alterace na DNA a chromosomech) genotoxiny = látky poškozující DNA klastogeny = látky vyvolávající chromosomální zlomy - terminologie není jednotná / přechody ... - Mutagenita a genotoxicita - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Typy mutací – znát principy 1)Bodové : delece, adice (zpravidla změna čtecího rámce: smrt) : záměny (změna jednoho tripletu (jedné aminokyseliny) à SNP: Single Nucleotide Polymorphism - Mutagenita a genotoxicita - Záměna T (Purin) à C (Pyrimidin) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Typy mutací – znát principy 2)Zlomy + chromozomové mutace 3) - Mutagenita a genotoxicita - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Mutageny jsou: 1)elektrofilní malé molekuly (vyhledávají nukleofilní/bazická místa … např. v NK) 2)další reaktivní látky - alkylující, acylující nebo arylující látky => kovalentní adukty s DNA à 1+2: „nespecifické“ reaktivní mechanismy 3) interkalátory DNA => cross-linking řetězců DNA à 3: „specifický“ mechanismus (jen látky s definovanou strukturou, velikostí…) - Mutagenita a genotoxicita - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Produkty vznikající z vody a kyslíku (chemikálie s nejvyšší koncentrací) radikály kyslíku: .OH, O2 . -, H2O2 vznik v průběhu metabolismu (viz dále), v přítomnosti reaktivních látek (radikálové reakce) v přítomnosti toxických kovů radiací Mutageny – příklady (1) http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0891584904001005-gr1.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kontaminanty, jejich metabolity, toxiny PAHs Plísňové toxiny atd. Reaktivní organické toxikanty epoxidy, episulfidy, laktony, aminy chinony azo-látky (heterocyklické PAHs) aromatické nitro-látky (NO2-PAHs) Mutageny – příklady (2) http://www.uoguelph.ca/%7Edjosephy/lab/images/mutagens.gif http://www.uoguelph.ca/%7Edjosephy/lab/images/mutagens.gif Znát příklady: Aflatoxin B1 BaP 2-AA, 2-AF EMS NQO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 „Arylace“ (benzo[a]pyren) „Alkylace“ cytostatikum cyklofosfamid Příklady reakci BaP Cyklofosfamid 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 Interkalační činidla Využití v experimentální biologii – značení DNA (ethidium bromid) 598-599 Interkalace: psoralen 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif - v organismu existuje rozsáhlý soubor reparačních mechanismů - reparační enzymové aparáty - některé jsou exprimovány konstitutivně (nízké úrovně) - některé jsou indukovány změnami v DNA (mutace) SOS repair, excisní reparace ... REPARAČNÍ MECHANISMY DNA 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1)Důsledky u lidí a zvířat Mutace tělních buněk (somatické mutace) à první krok karcinogeneze a dalších patologií (karcinogeneze, teratogenita: viz další přednášky) Mutace pohlavních buněk à přenost mutací na další generace (evoluce?) 2) Důsledky pro ekosystémy > změny genomu/genofondu přírodních organismů > adaptace na změny v prostředí à evoluce Příklady: Pesticidy à vznik rezistentního hmyzu Antibiotika à ATB-rezistentní bakterie Důsledky mutací / genotoxicity 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Inhibice enzymových aktivit 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Inhibice enzymových aktivit Řada (eko)toxikantů působí jako specifické inhibitory řady enzymů inhibice reverzibilní (nekovalentní) ireverzibilní (kovalentní) inhibice kompetitivní (v aktivním místě, na úrovni substrátu: viz příklady dále) inhibice nekompetitivní/alosterické (kovalentní vazby na jiném místě à nespecifická změna struktury/funkce 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif acetylcholinesteráza - klíčový enzym v přenosu nervových signálů (mezi neurony, mezi neuronem a svalem) -Inhibice Ach (organofosfátové pesticity, karbamáty …) à křeče, udušení Specifické inhibice enzymů - příklady 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif inhibice enzymů respiračních řetězců - Respirace & tvorba ATP - klíčový metabolický proces - Kyanid (C≡N), CO vazba na hemový komplex à nejrychlejší toxicita – mitochondrie à také v hemoglobinu, CYP450 atd. Specifické inhibice enzymů - příklady 1 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Účinky látek na sekundání a terciární strukturu proteinů (včetně enzymů) Narušení H-můstků alkoholy, aminy Iontové vazby kyseliny (COOH), zásady (aminy) toxické (těžké) kovy - Hg+2, Pb+2, Cd+2 , Ag+1 Tl+1, S-S můstky toxické kovy (reakce se sírou HS-) Detaily (domácí úkol): http://www.elmhurst.edu/~chm/vchembook/568denaturation.html Nespecifické mechanismy (reaktivní): denaturace http://www.elmhurst.edu/%7Echm/vchembook/images/568denathbond.gif http://www.elmhurst.edu/%7Echm/vchembook/images/568denatdisul.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Změny redox-potenciálu Oxidativní stres 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Změny redox-potenciálu - v buňce se přirozeně udržuje určitý stav redox-potenciálu - rovnováha oxidanty/antioxidanty -narušení rovnováhy à oxidační stres - -antioxidanty: kyselina lipoová, beta-karoten, glutathion, kys. askorbová (vitamin C) - - přirozeně vznikající oxidanty + radikály: - kyslík (!) a jeho deriváty = ROS (reactive oxygen species) .OH, O2 . -, H2O2 Přirozené zdroje oxidantů v buňce: mitochondrie oxidázy, CYP450 = detoxifikace DALŠÍ EFEKTY NA BIOCHEMICKÉ ÚROVNI 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Respirační řetězec v mitochondriích - zdroj elektronů à zdroj ROS - - - V řetězcích přírozeně zapojeny CHINONY - Cizorodé chinony – interference (rozpojení toku elektronů) à další ROS - Př. Chinony benzo[a]pyrenu - E3 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Xenobiotika - reaktivní toxické látky (epoxidy …) - metabolity vznikající při transformacích (detoxifikaci) - toxické kovy - redoxní cyklátory – např. chinony Ionizující záření reakce s vodou v buňkách à produkce ROS à základní mechanismus toxicity způsobené zářením ! Další zdroje „oxidantů“ v buňce http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0891584902007797-gr1.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Oxidativní stres = narušení rovnováhy oxidanty/antioxidanty Oxidační stres vzniká: à Zvýšením koncentrací oxidantů à Odstraněním antioxidantů (chronický oxidační stres) - velmi obecný mechanismus vyvolaný toxickými látkami - důsledky: chronické efekty – nemoci, rakovina, stárnutí ... Pozn: Druhý extrém narušení rovnováhy: ? Snížení koncentrací oxidantů - málo prostudováno (anoxie - častý stav v nádorech) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Oxidace - DNA - proteiny - fosfolipidy - à Toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Další specifické mechanismy Modulace gradientů na membránách Intraceulární receptory HSP 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif - v buňce se přirozeně udržují gradienty iontů (plazmatická membrána, ER, mitochondrie) Význam gradientů: - zajištění semipermeability - zajištění správného signálování (nízké koncentrace Ca2+) - gradienty H+ pro tvorbu ATP Toxické látky narušující gradienty - ionofory - usnadněný přenos iontů (např. antibiotika) - další mechanismy – viz dříve - rozpojování toku elektronů z respiračních řetězců (chinony) - blokace přenosu v respiračních řetězcích (kyanidy) Změny gradientů na membránách / semipermeabilita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce chemických látek s receptory pro přirozené ligandy = reakce s proteinovými receptory PROTEINOVÉ RECEPTORY A) Membránové receptory - přirozené ligandy - velké hormony (inzulin): menší význam toxických látek - malé signální molekuly (neurotransmittery): strukturně blízké malým mk toxikantů B) Intracelulární receptory Velký význam v ekotoxicitě à viz dále Kompetice toxických látek s přirozenými ligandy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Intracelulární (nukleární) receptory Nukleární receptory - přímo interagují s DNA (transkripční faktory) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Toxické látky interferují s ligandy nukleárních receptorů Nukleární receptory - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Intracelulární (jaderné) receptory Velký význam v ekotoxikologii ! Ligandy nukleárních receptorů – řada nízkomolekulárních hormonů estrogeny, androgeny, thyroidní hormony … Organické toxické látky: strukturní podobnost s hormony (!) à Specifické mechanismy a účinky (efekty při nízkých koncentracích) Důsledky: chronická toxicita velmi významných polutantů - persistentní látky - PCBs, PCDDs/Fs, DDT, - ftaláty a další aditiva (bisfenol A) - detergenty (nonylfenol) - nové typy pesticidů atd. Thyroxine Cortisol (Hydrocortisone) O HO OH H3C CH2OH C O HO O I I I I NH2 CH2 COOH H3C Testosterone O OH H3C H3C CH 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Aktivace AhR : - není znám přirozený ligand, nejsilnějším ligandem TCDD (!) - po aktivaci: - indukce detoxikačních enzymů (CYP1A1) - hyperfosforylace regulačních enzymů à proliferace (! nádory), apoptoza (imunotoxicita) … Aktivace ER - přirozeným ligandem ER jsou estrogeny (17beta-estradiol atp.) - efekty jsou závislé na typu buněk - proliferace (nádory), produkce hormonů, změny aktivit ... - nefyziologická hyperaktivace ER à xenoestrogenita (významný proces endokrinní disrupce) Nukleární receptory významné v ekotoxicitě AhR – receptor pro aromatické uhlovodíky (arylhydrocarbon receptor) ER – estrogenní receptor (také AR – androgenní receptor a další: méně prostudováno) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Ubiquitin (7 kD) -Reguluje DEGRADACI (poškozených) proteinů v proteazomech - Indukce stresových proteinů: Ubiquitin http://www.computescotland.com/images/ZQHKcZKusowKvypt6c0t0ad08c.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Objeveny při experimentech s teplotním stresem à indukce nízkomolekulárních proteinů (16 - 90 kD) Hsp - heat shock proteins Indukce Hsp následně prokázána i po působení jiných stresorů (UV, salinita, kovy, toxické látky …) Označování podle MW (Hsp90 = 90 kD, Hsp60 = 60 kD....) Jedna z funkcí hsp: skládání terciární a kvarterní struktury jiných proteinů a enzymů, transporterů nebo reparačních enzymů Obecná reakce na stres poplach – potřeba nových proteinů (reakce na „proteotoxicitu“, HSP – biomarker) à zvýšení spotřeby energie à zvýšení proteosyntézy Indukce stresových proteinů: HSP 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přehled mechanismů: ke každému znát principy, důsledky, příklady chemických látek Základní typy toxicity Nespecifická toxicita - nepolární narkotická toxicita (bazální toxicita) - polární nakotická toxicita - toxicita vyvolaná reaktivními látkami Specifická toxicita - inhibice enzymů, interakce s receptory apod. Konkrétní příklady - narušení přirozené fluidity membrány - interakce látek s DNA - inhibice enzymových aktivit - narušení redox-potenciálu - narušení gradientů na membránách - kompetice se substráty / přirozenými ligandy - indukce stresových proteinů Shrnutí