Úvod ke cvičením Mikrobiologie Andrea Teshim Podzim 2012 "The role of the infinitely small in nature is infinitely large" Louis Pasteur Sylabus cvičení •Příprava a sterilizace živných medií •Očkování a uchovávání mikroorganismů •Makroskopické a mikroskopické pozorování •Počítání životaschopných bakterií - sporulace •Izolace půdních mikroorganismů •Mikrobiologický rozbor vody •Barvení a pozorování pouzder a spor •Kvasinky •Bakterie a jejich citlivost na antibiotika •Základní biochemické testy • Cytologie a morfologie bakterií Anthony van Leeuwenhoek Z 50 – 275 x Janssenovi Z 9 x Anthony van Leeuwenhoek První nákresy bakterií (z ústní dutiny člověka) SEM Treponema pallidum útočící na membránu savčí buňky Bacillus anthracis Staphylococcus aureus na pokožce Ústní mikroflora Lactococcus lactis Proteus Morfologie •Buňky •Charakteristických shluků buněk •Extracelulárních útvarů (spory, • konidie, sporangia, pouzdra..) •Bakteriální kolonie Většinou druhově charakteristické = identifikační znak Pozor na: fázi růstového cyklu! endospory vyklenující buňku stáří kultury pleomorfní buňky Clostridium botulinum endospora buňka char.shluk kolonie sporangium spory Pleomorfní buňky rodu Corynebacterium Mycobacterium avium-intracellulare Acidorezistentní barvení buněk histologického řezu lymfatické uzliny Pleomorfní buňky M. tuberculosis Morfologie pleomorfních buněk. Další potíž: Jsou barvitelné Gramem? Haemophilus – ano Mykobakteria, mykoplazmata - nikoli Acidorezistentní buňky: Odmítají Gramovo barvení Odmítají se po nabarvení odbarvit ethanolem i kyselinou. Př: Corynebacterium, Nocardia… Bez b.s. Mykolové kys Bacillus megaterium ccm 2007 (nativni48noma) Bacillus megaterium ccm 2007 (3-nativni24-hallo) sarcina-nativni_5 Mycobacterium tuberculosis Zeihl-Neelsonovo barvení (červeně) Je neznámý vzorek vůbec barvitelný Gramem? Není gramlabilní? S barevným filtrem Cíl mikroskopie? Typ preparátu Typ mikroskopie (typ b. stěny, průkaz struktur, růstového cyklu) Živý (nativní) preparát bez fixace– vidíme nedeformovaný tvar buňky, spory, morfologii seskupení buněk, pohyb buněk Živé a mrtvé b., pohyb Fixov. prep. – tvar a typ b. Fixov. prep. nebarvitelný Gramem Morfologie buňky •PREPARÁT • - co chceme vidět? – podle toho preparát a typ mikroskopie • tvar buňky – fázový kontrast, barvený fixovaný prep. • • • • • • pohyb buňky – fázový kontrast, fluorescence • barvené struktury – pomáhají identifikaci (PHB, síra) • typ buněčné stěny – Gramovo a acidorezistentní b. • rychlá příprava nativního preparátu barvení buněk a spor za horka a struktur Gramovo barvení světelná mikro- skopie Světelná Fázový kontrast Fluorescenční Elektronová… U jednoho bakteriálního rodu různý vzhled char. tvaru buňky! •Př: tyčky bacilů •Haemophilus Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus subtilis 10 μm H. influenzae H. ducrei •Pseudomonas P. aeruginosa P. fluorescens Posuzujeme-li vzhled buňky určitého bakteriálního druhu, je třeba si uvědomit: •1) Prochází tento druh růstovými cykly? •- v každém z nich má pak buňka jinou morfologii! • Př: Chlamydia Bdellovibrio, Streptomyces, Caulobacter, myxobakterie…. •Mění se nejen vzhled buňky, •ale buňka v cyklech prochází •typickou změnou vnitřních •struktur. Buněčný cyklus Caulobacter crescentus • Bacillus Bdellovibrio Myxobakterie Morfologie buňky vprostřed buněčného cyklu • Životní cyklus rodu Bacillus - u některých jeho druhů i u jiných rodů navíc různá barvitelnost Gramem při různém stáří buněk – až gramlabilní při popisu preparátu nutno uvažovat stáří buněk! •2) Vytváří posuzovaný druh endospory? •- v preparátu pak mohou měnit tvar buněk! „Voják umírající na tetanus“ Sir Charles Bell lukovité prohnutí zad (opistotonus) křečovitý výraz Originál je k vidění: Royal College of Surgeons of Edinburgh, Scotland. Clostridium difficile Clostridium tetani Bacillus anthracis Endospory vs. exospory •G+ bakterie – endospory termorezistentní Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus, Thermoactinomyces •G- bakterie – exospory Méně rezistentní, odolné zejm.vůči vysychání Azotobacter, Methylosinus ALE: Př: Coxiella je G- a tvoří endospory! •Konidie: Actinobacteria Azotobacter Sporosarcina – balíčky 8 buněk fázový kontrast •3) Stárnutím mění buňky tvar •4) Závislost tvaru buňky na vnějším prostředí -živiny, tlak, osmolarita… •5) pleomorfní buňky – př. rody Mycobacterium, Corynebacterium, Haemophillus, Mycoplasma • Corynebacterium Pleomorfní mykoplazmata: nejmenší bakteriální buňky (0,2 – 0,3 μm); bez buněčné stěny! Poté: Nepůsobí betalaktamy Osmoticky stabilní v host.b. 1μm velké buňky se v cyklu střídají s elementár.tělísky výběžky Co je možno vyčíst z tvaru buňky •tvar buňky napovídá o metabolické aktivitě •(kokovité buňky vykazují max. metabol. aktivitu) Cytologie •BAKTERIÁLNÍ BUŇKA x vs. eukaryotní •nutno porovnat pro pochopení fyziologie •bakteriální buňka méně diferencovaná, ale: • - široký rozsah fcí membrány • - adaptabilita, genetická a fyziologická flexibilita • - málo buněčného materiálu, vysoká rychlost reprodukce • - jiná komunikace mezi buňkami (receptory, quorum sensing, pili), jiná organizace genet. materiálu a membrány, jiný typ pohybu a dělení buňky, bakteriální b. nemají endocytózu • •reakce v cytoplazmě, periplazmatickém prostoru či mimo buňku! •metody biochemické, mikroskopie – zde při pozorování struktur v preparátu pozor na artefakty (např. fixovaný preparát – mění podobu buňky) •studijím cytologickým napomáhají studie fyziologické a genetické • •- ribozomy - rozdíl proti eukaryotům, proteiny, jiná molekul biol • - genet materiál • - bičík - struktura a fce (G- versus spirochety - periplazma, typy lokomoce), gradient p+ ne ATP, pili, fimbrie - adheze, spiny • - inkluze (karboxyzomy, magnetozomy, S, PHB, krystaly - thuringiensis) • - pigmenty • ---- vztah k identifikaci, funkci pro buňku, pochopení fyziologie a naopak: př: morfologie genetického materiálu při kultivaci v různých mediích (jiná rychlost segregace a replikace genet. materiálu, jiná rychlost dělení buňky atd.) •rozdíly ve strukturách v říši bakterií - G+ a G- atd. •Cytoplazmaticá membrána a buněčná stěna: • • • •Buněčné povrchy • • •CYTOSOL: • peptidoglykan + složky v něm (teichoové k., mykolové kys) • druhy bez buněčné stěny - kde v taxonomii • CM membrána - poměry, fce a struktura proteinů, lipidů, vnější membrána G-, LPS, PS, LP, periplazma - mezozomy, fce na membráně, fotosyntéza, typy metabolismu • bílkovina, sacharid • imunita makroorganismu • výhody v prostředí (S-layer, pouzdra, slizy, biofilm) Morfologie charakteristických shluků buněk •typické shluky napomáhají identifikaci řetízky koků: Streptococcus řetízky bacilů: Bacillus palisády: Corynebacterium tetrády koků: Micrococcus balíčky = sarciny Sarcina hrozníčky: Staphylococcus Streptococcus Micrococcus Staphylococcus Bacillus Morfologie bakt. kolonií • •potřeba zvážit typ media, ne kterém kolonie hodnotíme! • kultivace - zda vůbec kultivovatelné?? - sledování typu kolonií • •Př: sledování morfologie kolonií • – univerzální media, jiný vhled na • selektivním – zda vůbec růst či ne? barevná reakce?) • S-, R- a M-formy • sledování pohybu terasovité kolonie (Př: Proteus) • Proteus Proteus – pohyb buněk Bacillus mycoides Serratia marcescens Streptomyces Streptomyces Morfologie bakteriálních kolonií I. na základních půdách Nocardia E.coli na krevním agaru E.coli na MacConkey agaru Lac+ E.coli na agaru EMB (Eosin Methylene Blue Agar) Bakteriální kolonie na II. diagnost. půdách Jeden druh bakterie různá media E.coli na C.L.E.D. mediu Cysteine Lactose Electrolyte Deficient Agar Mycobacterium tuberculosis obohacená a selektivní Löwenstein-Jensenova medium selektivní až na kmen! Detekce kmene E. coli O157:H7 proti jiným kmenům E. coli Bakteriální kolonie na III. selektivních půdách DSCN0760 Kontaminace na misce! • Cytologie •BAKTERIÁLNÍ BUŇKA x vs. eukaryotní •nutno porovnat pro pochopení fyziologie • • Zvláštnosti prokaryotické buňky •živý, otevřený systém schopný regulace a autoreprodukce •jádro neodděleno od CPL membránou, větš. kruhová (i lineární) DNA •haploidní buňky (1 alela) množící se nepohlavně •bez buněčných organel, jediná membrána je cytoplasmatická •ribosomy se liší od ribosomů eukaryotních buněk – menší, volně v CPL vyjma Archea: •5S, 16S a 23S rRNA • translace začíná N-formylmethioninem • geny pro RNA bez intronů •specifické struktury a vlastnosti bakt. buňky: • peptidoglykan (až na mykoplasmata) • steroly v membránách zcela výjimečně • bičík – globul. bílk. flagelin, pohyb rotací • anaerobiosa, schopnost vázat N • tvorba kyseliny PHB (zásob.l.) • pokud fotosyntéza - anoxigenní bakteriální ribozom G- G+ E. coli S. aureus peptidoglykan •Aeromonas •Aeromonas hydrophila •Aeromonas hydrophila ssp. hydrophila •Aeromonas hydrophila ssp. hydrophila CCM 7232 T •Aeromonas hydrophila ssp. hydrophila CCM 1271 • CCM 1275 • • • Př: klasifikace: rod Aeromonas GENUS rod SPECIES druh SUBSPECIES poddruh 22 species ,, STRAIN kmen Česká sbírka mikroorganismů (CCM) •uchovává kultury bakterií a hub pro • - základní a aplikovaný výzkum • - průmyslové využití, biotechnologii • - referenční kmeny pro klinické laboratoře • humánního a veterinárního zaměření • - výuku •2 500 kmenů bakterií (~ 280 rodů, 930 druhů) •600 kmenů vláknitých hub (~ 200 rodů, 560 druhů) Bezpečnost a zásady práce Plášť, přezůvky, skříňky, jídlo, pití Mytí rukou; test účinnosti mytí rukou Stoly – před a po práci Incidur !! : případně MO – Biohazard group 0 ethanol Kahan zapnutý jen po dobu práce s ním Nemluvit při očkování mikroorganismů Popisování misek: zespodu, na dno na víčko u polotekutého media O náplni cvičení se informovat předem Viz Studijní materiály – prosím příprava Nevylévat nic do odpadu, prosíme neodnášet kultury