NEURÁLNÍ A BUNĚČNÉ PROCESY SMYSLOVÉ TRANSDUKCE – JAK SMYSLOVÉ PODNĚTY VSTUPUJÍ DO NERVOVÉHO SYSTÉMU. A CO UŽITEČNÉHO Z TOHO PLYNE? • Co se děje na membránách smyslových buněk, jak mohou smyslové podněty zasáhnout do metabolismu buněk? • Paralely se známými signálními drahami diferenciace, imunity, apoptózy… • Společně využívané „vyzkoušené“ funkce a vztah mezi studiem chování, smyslů a buněčné komunikace Východiska a cíle Schopnost organizmů rozpoznávat i nepatrné změny vnějšího prostředí a reagovat na ně v případě ohrožení je jednou z nejdůležitějších podmínek zachování života. Selekční tlak byl natolik silný, že schopnosti receptorů jsou často na samé hranici fyzikálních možností. Jednotlivé fotony, jednotlivé molekuly, pohyby nanometrových amplitud, nesmírně slabé elektromagnetické pole fascinují fyziology. Výzkum molekulární podstaty transdukčních mechanismů chemických signálů, infračervené detekce, elektrických polí nebo magnetického pole jsou výzvami fyziologii s velkým potenciálem. Všech 5 pohromadě Vstup do NS, potřeba rychlé motorická reakce, kontakt s vědomím. Kontakt se světem Předpoklad: některé buňky dokážou reagovat na různé formy energie (chemické, mechanické, elektromagnetické). Metabolická reakce se pak zobrazí jako změna elektrického membránového napětí. Motorický NS Vegetativní NS Hormonální S Kůra telencefala Vnější podněty: zvuky, vůně… Vnitřní podněty: hladina Glc, apoptotický signál, růstový f. … VĚDOMÍ PODVĚDOMÍ Reflexní, automatické řízení Buněčná recepce a komunikace Hranice smyslového a ne-smyslového signálu Buněčné „oči“ a „uši“ Motorický NS Vegetativní NS Hormonální S Kůra telencefala Vnější podněty: zvuky, vůně… Vnitřní podněty: hladina Glc, apoptotický signál, tah v membráně… VĚDOMÍ PODVĚDOMÍ Reflexní, automatické řízení Buněčná recepce a komunikace Motorický NS Vegetativní NS Hormonální S Kůra telencefala Vnější podněty: zvuky, vůně… Vnitřní podněty: hladina Glc, apoptotický signál, tah v membráně… VĚDOMÍ PODVĚDOMÍ Reflexní, automatické řízení Buněčná recepce a komunikace Klasické smysly propojené s kůrou, mechanismy ale stejné  Nervový systém vsadil na elektricky předávané informace.  Kanály jsou odpovědné za regulaci membránového napětí a tedy klíčové pro vznik a přenášení nervových signálů.  Nervový systém tedy „vidí“ jen to, co změní kanálovou propustnost.  Zajímá nás: co se děje mezi receptory a kanály Kanály v molekulární fyziologii smyslů Ionotropní transdukce – receptor přímo na kanálu Klíčová otázka: co se děje mezi receptory a kanály Metabotropní transdukce Kanály – prostředek pasivního transportu udržování integrity buňky a komunikace Už jste se potkali s kanály? Už jste se potkali s kanály? IP3 a Ca signál Už jste se potkali s kanály? Vodní hospodářství je otázkou řízené propustnosti membrán. Už jste se potkali s kanály? Už jste se potkali s kanály? Už jste se potkali s kanály? Kanály tedy transportují látky i předávají signály: Spolupracují na udržení osmolality a membránového potenciálu - nezbytný pro aktivní transport. Transporty konkrétně např.: sekrece pankreatické šťávy, žaludeční šťávy, sekrece a resorpce ve vylučování, resorpce ve střevě, osmotická a pH rovnováha, Podílí se na signalizaci i mimo NS: celá Ca signalizace, svalový stah, buněčné signály Poruchy kanálů – např. srdce, cystická fibróza, vznik malformovaných metastazujících buněk. Jak se kanály zkoumají? Terčíkový zámek (Patch clamp) – vidíme, jak kanál pracuje Jak se kanály zkoumají? analýza sekvence AK – Prostorová rekonstrukce ze složení řetězce. X ray krystalografie - vzhled FOTORECEPCE - ZRAK Rhodopsin Od 70. let obecné schéma G-proteinové signalizace Nejprozkoumanější kaskáda Prostetická skupina – chromofor nezbytná pro absorpci vyšších délek Chromofor ve funkci ligandu, světlo iniciuje Drosophila jako užitečný model zrakové (a i jiné) transdukce: Mimořádné zesílení – reakce na jediný foton Nízký šum ve tmě (spontánní termální izomerizace) Široká adaptace – rozsah až 106 (arestin, Ca) Rychlá terminace odpovědi Nejrychlejší známá G signální dráha – 10x než obratlovci (10Hz u člověka) fosfolipáza Drosophila jako užitečný model zrakové transdukce: Taková rychlost? PLC octomilky je jeden z nejvýkonnějších známých enzymůlimitem je jen přísun cGMP Výkonnost transdukce omezena pouze difuzním pohybem v membráně. Drosophila jako užitečný model zrakové transdukce: Difuzní model signálového přenosu x Signalplex, scaffolding proteins Multimolekulární signalizační komplex zvyšuje rychlost a specifitu „rozhovorů“ Drosophila jako užitečný model zrakové transdukce: Organizace proteinů signalplexu v čase a prostoru – oddělení, zhášení v odpověď na světlo How does a light stimulus lead to the opening of TRP channels? Surprising link between light-activated changes in membrane tension and the opening of TRP channels 12 OCTOBER 2012 VOL 338 SCIENCE The conclusion follows from a striking observation that light causes a contraction in the fly photoreceptors. Hardie and Franze quantitate this movement with atomic force microscopy and show that it reaches a peak of ~400 nm, with an onset that precedes the onset of the phototransduction current. … change in membrane tension that occurs when PIP2, which contains a bulky head group, is converted to the slimmer DAG molecule in the inner leaflet of the plasma membrane. To alleviate this stress, the inner leaflet compresses, causing a tiny constriction in the diameter of the microvilli. Because microvilli are arranged in stacks of ~1500, a small change in the diameter of the microvilli is amplified into a large change in length of the rhabdomere. This result is remarkable because, although it is well recognized that changes in phospholipid composition can change membrane curvature, bilayer thickness, and membrane stress, there was little prior evidence that PIP2 hydrolysis could produce a measurable change in the shape of a living cell. Drosophila jako užitečný model zrakové transdukce: Taková adaptace? Translokace TRP – mechanismus adaptace na tmu a světlo Chemorecepce - čich Všechny buňky umí čichat ! Nejstarší smysl Konzervativní organizace Podobnost s rhodopsinem Jeden neuron – jeden receptor Rozeznává tisíce látek 1000 genů – 3% ! Hypervariabilní oblast G-prot. signální dráha G-prot. signální dráha 2004 Nobelova cena 50% léků přes G-proteinové signální dráhy Jeden neuron – jeden receptor – jedna základní vůně Téměř neomezené množství kombinací-distanční imunitní sst. (?) Specifická „mozaika“ aktivace pro konkrétní vůni CHEMORECEPCE - CHUŤ G-prot. signální dráha vlastně gustducinová Přímý vliv Matters of taste Recepční struktury chuti CHUŤ NA TUČNÉ • CD36 – receptor na lipidy (?), scavenger receptor, v metabolismu lipidů, zánětu, hemostáze, ateroskleróze, tlaku, při malárii sekvestrace Ery http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=potential-taste-receptor Behaviorální chemorecepční testy – nasátí barvy, vysunutí sosáku, volba vůně MECHANORECEPCE – HMAT, SLUCH Sluch, hmat, rovnováha, osmorecepce, hygrorecepce Zrychlení Magnetorecepce? Dlouho neznámý mol. mechanismus Modelový organismus háďátko Modelový organismus octomilka Mutanti byli defektivní pro dotyk. Podobně i mutanti drosophil. Larvy, které nebyly citlivé na dotek, byly v dospělosti hluchými mouchami s nekoordinovanými pohyby. Princip je zřejmě dosti konzervovaný a obecný pro různé aplikace mechanorecepce. Mutace se týkaly kotev na jedné nebo druhé straně membrány nebo kanálu samotného. Kanál opět patří do rodiny TRP. Savčí mechanorecepce sluchu Rychlá a pomalá adaptace: -Aktivní pohyb v rytmu (zesílení) -Nastavení napětí spoje (adaptace) Mechanorecepce může přímo řídit expresi Např. růst svalů Moyes … nebo uvolňování chemických signálů řídících srdeční činnost. NOCICEPCE – VNÍMÁNÍ BOLESTI V případě zraku nebo čichu potřebují primární neurony jediný druh stimulu. Nocicepce je jiná v tom, že primární neurony dráhy bolesti mají schopnost detekovat širokou škálu modalit včetně chemické a fyzikální povahy. Musí být tedy vybavena rozmanitým repertoárem transdukčních zařízení. Na rozdíl od zraku chuti nebo čichu nejsou nervová zakončení pro bolest lokalizována v nějaké anatomické struktuře, ale jsou rozptýlena po celém těle, v kůži, svalech, kloubech vnitřních orgánech. Jsou různé typy vláken, o kterých se předpokládá, že vedou různou rychlostí a zprostředkovávají akutní, ostrou prudkou bolest a jiná difúzní, pozdní bolest tupou. Receptory jsou obvykle polymodální, odpovídající jak na teplotu, tak na mechanické stimuly a na poranění tkáně. Odpověď na horko je jednou z nejprostupovanějších bolestivých odpovědí. Na rozdíl od čichu nebo fotorecepce polymodalita nociceptorů – chemické, fyzikální i teplotní stimuly Receptory jsou rozptýleny po celém těle Jste li u zubaře a necháte-li si aplikovat anestezi, anestetika blokují všechny napěťově řízené sodíkové kanály. To zablokuje jakékoliv čití a i motorické funkce. Nyní však byly objeveny sodíkové kanály, které jsou pouze v neuronech vnímajících bolest. To je výzva pro farmaceutické laboratoře, aby našly „kouzelnou kulku“ selektivně na ně. Jinou cestou bylo studium TRPV1 kanálu, který je otevírán kapsaicinem, nebo teplotami nad 42°C. Ten se vyskytuje pouze na nociceptorech. Takže jeho blokáda způsobí anestezii bez paralýzy. MAGNETORECEPCE Varianta mechanorecepce- Magnetit? Johnsen, S. and Lohmann, K. J. (2008). Magnetoreception in animals. Physics Today March, 29-35. Varianta mechanorecepce- Magnetit? Varianta mechanorecepce- Magnetit? VARIANTA FOTORECEPCE? Fotochemický model založený na reakcích radikálových párů. Singletový stav Tripletový stav Opsin-cis retinal v základním stavu Energie Trans retinal + opsin ISC excitace fotonem rozpad recepce světla únik do dalších reakcí Spontánní oscilace mezi dvěma stavy. Posun v pravděpodobnosti výtěžku reakce. Magnetická síla •Nejpravděpodobnější kandidáti na magnetoreceptor zrakové dráhy. •Signální proteiny zvířat i rostlin, homologní DNA fotolyázám. •Součástí biologických hodin. Kryptochromy: Superoxidový anion obsazuje molekulární kapsu kryptochromu a tvoří radikálový pár [FADH + O2 °-], který se nachází v singletovém (25 %) nebo tripletovém (75 %) stavu. Kryptochromy: http://www.ks.uiuc.edu/Research/cryptochrome/ Kryptochrom je deaktivován, jestliže elektrony radikálového páru jsou v singletovém stavu. Magnetické pole tak ovlivní dobu po kterou je kryptochrom v aktivním – signálním stavu. Kryptochromy http://www.ks.uiuc.edu/Research/cryptochrome/ Solov’yov, I. A., H. Mouritsen, and K. Schulten. 2010. Acuity of a cryptochrome and vision-based magnetoreception system in birds. Biophysical Journal 99: 40-49. Je-li Cry fixován na membránu polokruhovité struktury a napojen na zrakovou dráhu, mohl by vytvořit „magnetické obrazce“. Solov’yov, I. A., H. Mouritsen, and K. Schulten. 2010. Acuity of a cryptochrome and vision-based magnetoreception system in birds. Biophysical Journal 99: 40-49. Reakce je směrově specifická a některé receptory budou ovlivněny více než ostatní. Je-li Cry fixován na membránu polokruhovité struktury a napojen na zrakovou dráhu, mohl by vytvořit „magnetické obrazce“. ELEKTRORECEPCE Lorenziniho ampule •Pasivní – detekce napětí vznikající svalovou a nervovou činností •Aktivní – podobá se echolokaci •Navigace •Detekce kořisti v kalných vodách •Komunikace Lorenziniho ampule – změna potenciálu otevírá Ca2+ kanály a stimuluje eflux mediátoru } Kanály řízené (vrátkované) napětím CÍTĚNÍ PŘES TRP KANÁLY TRP – TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL Objeveny v oku octomilky 1969 Univerzální buněčné sensory změn v okolním prostředí – slouží i organismům Evoluční specializace na zrak, čich, chuť, sluch, dotek, osmolalitu, teplotu, bolest. TRP superrodina je specifická třída kanálů, které se otevírají v odpověď na celou škálu chemických a fyzikálních stimulů. Díky této škále vrátkování, TRP kanály slouží jako univerzální senzory, které dovolují buňkám a celým organizmům detekovat změny v jejich prostředí. Během evolučního vývoje došlo k pozoruhodné specializaci těchto bílkovinných komplexů tak, že mohou měnit svou konformaci vlivem různých chemických i fyzikálních podnětů: mohou hrát roli při zraku, čichu, chuti (sladka, hořka a umami), sluchu, doteku, osmolality, pH, teploty, bolesti od kvasinky a háďátka přes Drosophilu k člověku. Tedy téměř všech prozkoumaných modalit. Některé TRP kanály jsou přímo receptory, zatímco jiné jsou efektory výše stojících s G-proteinem spřažených receptorů. Některé TRP kanály fungují jako buněčná čidla, která převádějí změny okolního prostředí na produkci druhých poslů uvnitř buněk, a to především vápníku, čímž dochází k aktivaci nebo modulaci činnosti dalších receptorů. Citlivost na kyselo a horko, ale i dráždivé látky Receptory bolesti Termoreceptory Chladu a horka Molekulární identifikace teplotně aktivovaného iontového kanálu TRPV1, který se uplatňuje v přenosu bolestivých podnětů na primárních nociceptivních neuronech, vedla k prudkému zvýšení zájmu fyziologů o další iontové kanály této skupiny a díky rozsáhlým genomickým projektům ukázala existenci obecných molekulárních principů senzorické transdukce. U člověka bylo dosud identifikováno 27 genů pro TRP receptory a jejich fyziologická úloha byla prokázána v souvislosti s některými onemocněními, jako jsou poruchy metabolizmu hořčíku (hypomagnezémie), polycystická onemocnění ledvin, nebo mukolipidózy (poruchy odbourávání glykoproteinů a jejich hromadění ve tkáních). Některé podtypy TRP receptorů se nacházejí v nedráždivých buňkách, jako jsou např. keratinocyty, ledvinný epitel a prostata. Jak testovat termosensitivu? Mechanosensitivita TRP Háďátko se nevyhýbalo doteku, ani škodlivým látkám Drosophila hluchá a špatně chodící 3 možné mechanismy a) Tenze membrány b) Tenze kotvy cytoskeletu c) Změna aktivity enzymu Mechanosensitivita TRP Sluch FrontiersinPhysiology | MembranePhysiologyandBiophysics August2012|Volume3|Article324 | 4 TRP channels: sensors and transducers of gasotransmitter signals TRPA1 and TRPV1 function as polymodal signal integrators capable of detecting chemically diverse products of cell and tissue injury. In doing so, these channels promote pain hypersensitivity by depolarizing the primary afferent nerve fiber and/or lowering thermal or mechanical activation threshold. TRP v recepci lokálního buněčného prostředí – buněčná signalizace TRP v recepci lokálního buněčného prostředí – buněčná signalizace Vazomotorika, transport tekutin přes membrány, hormony, sekrece inzulínu. Neurodegenerace přes oxidativní stres, kardiovaskulární nemoci, sensorické deficity, abnormální reakce na bolest, gastrointestinální, renální, neurodegenerativní poruchy, astma, onkologické a i psychiatrické poruchy. Studium TRP kanálů je zajímavé nejen pro jejich univerzální roli ve smyslové transdukci, ale i směřuje k hlubšímu porozumění mechanizmům, které se uplatňují při vzniku některých onemocnění nervového systému a k cílenému hledání prostředků pro jejich léčbu. Jejich studiem se blížíme pochopení Ca citlivých mechanismů Ca regulace neexcitabilních buněk jako je aktivace T buněk, řízení apoptózy, proliferace, sekrece a buněčné migrace. • Závěrem: Buňky konzervativně využívají již vyzkoušených mechanismů k předávání signálů. Schopnosti buněk vidět, slyšet, čichat se svými mechanismy neliší od schopností regulovat vývoj, zrání, diferenciaci, transport, metabolismus a homeostázu. Studiem smyslových schopností poznáváme obecná pravidla molekulární komunikace. • Úloha bezobratlých jako modelu • Úloha neuroetologie