Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií Bi7050 Část III Zbyněk Zdráhal Centrální laboratoř-Proteomika, CEITEC-MU Oddělení funkční genomiky a proteomiky, ÚEB PřF zdrahal@sci.muni.cz www.sci.muni.cz/FGP Oddělení funkční genomiky a proteomiky Přírodovědecká fakulta MU Analýza proteomu * proteinů je podstatně víc než genů lidský genom obsahuje ~21 000 genů, ale lidský proteom může obsahovat ~ 1 000 000 proteinů a jejich forem (izoformy, PTMs) (http://www.expasy.org/sprot/hpi/hpi_desc.html) ~ 10 000 proteinů v buňce v každém okamžiku * široký rozsah koncentrací proteinů (~ 10 řádů) nutnost účinné separace majoritních proteinů od minoritních, chybí obdoba PCR reakce používané pro amplifikaci DNA * široké spektrum fyzikálně-chemických vlastností * analýza komplexů pro úplné pochopení buněčných procesů mnohdy nestačí prostá identifikace jednotlivých proteinů, cca 80% je funkčních jako součást komplexů MM900282753[1] GIGO Pečlivá příprava vzorku – základní kámen úspěchu Bi7050 zachování původního proteinového složení zachování modifikací (např. inhibitory fosfatáz) ... Keratiny !!! from skin, hair, nails, wollen clothes …. EVERYWHERE keratins In-gel digestion of very weak Ag stained band Bi7050 * zbytky media * detergenty * netěkavé pufry * EGs * .... tomato Standardní 1-D postupy 1-D GE Specifické proteolytické štěpení Separace proteinů MS/MS Separace naštěpených peptidů Specifické proteolytické štěpení Bi7050 MALDI-MS/MS LC-MS/MS JEDNODUCHÉ SMĚSI 1-D LC-MS/MS shotgun proteomics Proteinový extrakt fága – 1-D separace Bi7050 Iden. – 5 majoritních proteinů LC/MSMS kDa 66.2 45.0 31.0 21.5 14.4 97.4 GE cca 50 bandu LOGO koncentrační rozsah snížená možnost detekce minoritních komponent rozhoduje instrumentace podmínky LC separace popandai Bi7050 2-D GE 2-D LC-MS/MS Specifické proteolytické štěpení Separace proteinů MS/MS Separace naštěpených peptidů Specifické proteolytické štěpení Klasické 2-D postupy 2-D LC-MS/MS MALDI-MS MALDI-MS/MS on-line/off-line LC-MALDI fag 812-Ag 2006-08-18 2-D GE/MALDI-MS Bi7050 Proteinový extrakt fága – 2-D separace ≈ 700 skvrn ≈ 20 proteinů LOGO Bi7050 Protein mix digesce 2D - RP MS/MS 1D - SCX On-line (“MudPIT”) frakcionace step by step 2D - RP MS/MS Peptide fraction 1D - SCX Off-line UV Peptide fraction Peptide fraction Peptide fraction Peptide fraction Peptide fraction Peptide fraction Peptide fraction LC 2-D LC peptides MudPIT (multidimensional protein identification technology) Bi7050 2-D LC peptides Bi7050 2-D LC (peptides) 1D-RP 2D-RP, frakce 5 mM 2D-RP, frakce 50 mM 2D-RP, frakce 100 mM Dionex application note Bi7050 Průměr HPLC kolony vs citlivost „Sensitivity increases with a decrease in column diameter because the same sample mass (amount) is eluted in a smaller volume. Therefore the concentration of the eluting peak is higher and the detection signal is stronger.“ Amer. Lab., 2001, 33 (10), 26-38. Bi7050 sorbenty 1-D: ionex 2-D: reverzní fáze IMAC (fosfoproteiny) affinity (lectin – glyko) 2-D LC peptides On-line vs Off-line automatizace flexibilita optimalizace kontinuální odběr frakcí LC –MALDI (peptides) Bi7050 Peptide fraction nano LC (RP) ESI-MS/MS on-line MALDI TOF/TOF MS off-line Depozice na MALDI target Archivace Avesome_Spectecle LC separace komplexních proteinových směsí Protein mix Protein 1D frakce Frakcionace I. Ionex, SEC, …. Frakcionace II. Protein 1D frakce Protein 2D frakce RP exp. exp. Protein 2D frakce digesce 1D (2D) HPLC ESI-MS/MS Bi7050 LC separace komplexních proteinových směsí Bi7050 LC –MALDI (proteins) Bi7050 (2 –D) LC ProbotPreNeedle MALDI TOF/TOF off-line 1. Depozice na MALDI target Protein mix 2. Digesce na destičce CE Bi7050 Kombinace GE a HPLC separace slices protein fractionation digesce nano 1-D LC 1-D GE ESI-MSMS nebo IPG strip často používané pro analýzu proteinových komplexů from Carter et. al. The Plant Cell, 2004, 16, 3285–3303. Bi7050 2D-On-line 2D-Off-line (3D ?) Bi7050 from Carter et. al. The Plant Cell, 2004, 16, 3285–3303. Bi7050 Depletovaná plazma (3500 – 9000 proteinů ??) IEF (liq) 20 frakcí 1. rozměr LC (RP) 1600 frakcí 2. rozměr GE (1D/2D) ∞ frakcí 3/4. rozměr from H. Wang, Molecular & Cellular Proteomics, 2005, 4, 618–625. 0. rozměr Celková analýza proteomu (screening) Bi7050 from A.D. Zoumaro-Djayoon et al. / Methods 56 (2012) 268–274 Cílená analýza imunoafinitní frakcionace (Y(phos)) Bi7050 from K. Bluemlein et al. / Nature protocols 6 (2011) 859 –869 Cílená analýza jednotlivých proteinů Parent mass Fragment mass CID Q1 Q3 Q2 Q1 „fix“ Q3 „fix“ * kvadrupol Q1 i Q3 jsou nastaveny na vybrané hodnoty m/z (prekurzoru a vybraného fragmentu), zaznamenány jsou jen prekurzory, z kterých při fragmentaci v kolizní cele Q2 vzniká určený fragment * během analýzy lze sledovat více reakcí (MRM) BLESSED High throughput Bi7050 Bi7050 + Miniaturizace - chip technologie Bi7050 MS Charakterizace Modifikací 1htb Phos N-terminus C-terminus Bi7050 + + + + b1 b2 b3 b4 b- ion serie + + + + y1 y2 y3 y4 y- ion serie N-terminus (c-serie) C-terminus (z- serie) Fragmentace peptidů – CID vs ETD Bi7050 CID ETD b, y c, z Proč analýza modifikací proteinů? Možnosti MS při analýze modifikací Ø Druh Ø Místo Ø Úroveň Bi7050 j0286034 MCj04042630000[1] Bi7050 Druhy modifikací: Ø mutace (záměna AMK) Ø Ø chemické Ø posttranslační Užitečný přehled modifikací: DeltaMass http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home ExPASy - http://www.expasy.ch/ Bi7050 „Chemické“ modifikace: q záměrné modifikace (karbamidometylace Cys, N –terminal acetylace, PSD derivatizace, kvantifikační značky aj.) q nechtěné modifikace (oxidace Met, deamidace N à D při purifikaci, adukty farmak) j0195384 MCj02871590000[1] Bi7050 Amines (K/N-terminus) Methylation +14.0269 Formylation +28.0104 Acetylation +42.0373 Lipoic acid +188.3147 Farnesylation +204.3556 Myristoylation +210.3598 Biotinylation +226.2994 Palmitoylation +238.4136 Stearoylation +266.4674 Geranylgeranylation +272.4741 Acids & amides (E/D/Q/N) Pyroglutamic acid (Q) -17.0306 Deamidation (Q/N) +0.9847 Carboxylation (E/D) +44.0098 Hydroxyl groups (S/T/Y) Phosphorylation +79.9799 Sulphation +80.0642 Carbohydrates (S/T/N) Pentoses +132.1161 Deoxyhexoses +146.1430 Hexosamines +161.1577 Hexoses +162.1424 N-acetylhexosamines +203.1950 Sialic acid +291.2579 Common Posttranslational Modifications Další detaily: http://web.indstate.edu/thcme/mwking/protein-modifications.html Bi7050 MS Charakterizace mutací Blue tissue paper Bi7050 wild type 179 - 203 NWLTFNEPQTFTSFSYGTGVFAPGR 2824 E186Q Q 2823 peptide mass difference: - 1 Da 2800 2810 2820 2830 m/z 300 400 500 600 700 800 900 1000 a.i. 2799.73 2824. 65 Zm-p60.1 wild type 2799.85 2823. 82 Zm-p60.1 E186Q Potvrzení výměny AMK na peptidové úrovni Protein: Zm-p60 (pozice 186) In-gel digesce MALDI-TOF MS 1 Da LC-MSMS nalezena mutace D/E v pozici 210 ... DEEELQKENVKNTASLTGKITLSVTQSKPETGEVIGVFESIQPSDTDLGAKVPKDVKIQG ... Bi7050 Identifikace výměny AMK na aminokyselinové úrovni Protein ve dvou variantách v jednom spotu na 2-D gelu Vstupní informace: Změna hmotnosti tryptického peptidu: –14 Da ... DEEELQKENVKNTASLTGKITLSVTQSKPETGEVIGVFESIQPSDTDLGAKVPKDVKIQG ... MALDI-MS potvrzení změny hmotnosti daného peptidu (2 proteázy) MALDI-PSD nejednoznačné výsledky Bi7050 933.5 951.7 970.6 +MS2(1004.0), 32.1min (#878) 0 100 200 300 920 930 940 950 960 970 m/z 927.2 945.0 956.4 +MS2(997.4), 32.6min (#887) 0 100 200 300 Ion b9 LSVTQSKPX D / E m/z MSMS peptidu LSVTQSKPXTGEVIGVFES, MW 2006.0 (1992.0) D E 1+ 1+ -14 „Nemodif“ – detail MS/MS spektra „Modif“ - detail MS/MS spektra m/z 956 m/z 970 „Modif“ MS2 (997.4, 2+) „Nemodif“ MS2 (1004.4, 2+) Rt (min) EIC chromatogram EIC chromatogram m/z Bi7050 LC-MSMS methylace, potvrzení D v pozici 210 po derivatizaci výměna H za CH3 na karboxy skupině tj. D = 14 Da/skupinu VTQSKPX*TGE*VIG* y8 y8 nederiv m/z 787.2 pro D y8 methyl m/z 829.3 pro D D = 42 Da m/z 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 850 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 [Abs. Int.] y8 787.7 y8 829.3 42 Da MSMS peptidu VTQSKPXTGEVIG před a po methylaci Bi7050 Bi7050 MS Charakterizace modifikací „chemické“ nemodifikovaný peptid 2060 Peptid + X 2222 Bi7050 MALDI–MS spektrum digestů před a po modifikaci (výřez spektra) 162 Da 1256 1261 1266 1271 1276 m/z 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 a.i. MALDI–MS spektrum – Oxidace Met (výřez spektra) 16 Da Sample prep artefact (Sypro Ruby) Bi7050 1. gi|15803837 Mass: 13532 Score: 487 Queries matched: 5 50S ribosomal protein L14 [Escherichia coli O157:H7] Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Score Peptide ……. 939.45 1876.89 1876.88 0.02 0 (125) MIQEQTMLNVADNSGAR 947.44 1892.87 1892.87 -0.01 0 159 MIQEQTMLNVADNSGAR + Oxidation (M) 947.45 1892.88 1892.87 0.01 0 (147) MIQEQTMLNVADNSGAR + Oxidation (M) 955.45 1908.89 1908.87 0.03 0 (118) MIQEQTMLNVADNSGAR + 2 Oxidation (M) ……. Výsledek identifikace proteinu (Mascot) Jen část týkající se modifikovaného peptidu (Petra P. Vz. 3, 080821) D m/z 8 (16) ……. 16 (32) Bi7050 EIC: m/z 939.5 (2+) m/z 947.4 (2+) m/z 955.4 (2+) LC-MS/MS 1x Ox 1x Ox 2x Ox Bi7050 MS/MS spektrum nemodifikovaného peptidu - MIQEQTMLNVADNSGAR Bi7050 MIQEQTMLNVADNSGAR Posuny v m/z vybraných fragmentů pro jednotlivé případy M(ox) y10 y10 – LNVADNSGAR b9 – M1IQEQTM7LN b9 y11 y11 – M7LNVADNSGAR bez 1 Ox 1 Ox 2 Ox M1 M7 oba y10 0 0 0 0 y11 0 0 16 16 b9 0 16 16 32 Bi7050 M7 - ox nemodifikovaný M1 - ox M1, M7- ox y10 – LNVADNSGAR y11 – M7LNVADNSGAR y10 1016,5 y10 1016,5 y10 1016,5 y10 1016,5 y11 1147,6 y11 1163,6 y11 1163,6 y11 1147,6 b9 1089,5 b9 1105,5 b9 1105,5 b9 1121,5 b9 – M1IQEQTM7LN Bi7050 + posun celé b serie (b3 - M1IQ) +16 +16 +32 +16 +16 0 Bi7050 LC-MSMS spectrum (výřez spektra) Potrzení modifikace na Cys 200.3 246.1 268.1 285.4 300.0 315.3 349.3 383.3 410.1 428.2 448.2 478.5 522.2 0 1000 2000 3000 Intens. 200 250 300 350 400 450 500 m/z y2 y3 y4 C …VC*AR 200.4 246.4 285.5 314.9 384.0 410.5 441.4 455.9 468.1 493.3 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 4 x10 Intens. 200 250 300 350 400 450 500 m/z y3* y2 C + modifikace modifikace 5340 Ac Ac ? 5340 5382 Fragment with one E Ac Fragment with two E Ac Non-acetylated fragment Histon H3, lokalizace acetylace (in-vitro) MALDI-MS digestu (detail spektra) Bi7050 0 250 500 750 1000 1250 1500 5250 5300 5350 5400 5450 5500 5550 5600 5650 5700 5750 m/z Bi7050 T G G K* 1246.4 c 11 1303.4 c 12 1360.4 c 13 1530.4 c 14 42 Da Histon H3, lokalizace acetylace K(14) MALDI-ISD MS (detail spektra) ARTKQTARKSTGGKAPR c14 c13 Bi7050 Konec III. části Bi7050