Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií Bi7050 Část IV Zbyněk Zdráhal Centrální laboratoř-Proteomika, CEITEC-MU Oddělení funkční genomiky a proteomiky, NCBR PřF zdrahal@sci.muni.cz Oddělení funkční genomiky a proteomiky Národní centrum pro výzkum biomolekul Přírodovědecká fakulta MU nfsnf Bi7050 MS Charakterizace modifikací posttranslační Bi7050 Fosforylace Phosphorylation sites db: http://phospho.elm.eu.org Whereas phosphorylation of serine, threonine or tyrosine results in the formation of a phosphoester linkage, phosphorylation of histidine residues occurs on nitrogen atoms, producing a phosphoramidate bond. Phosphohistidines have a large standard free energy of hydrolysis making them the most unstable of any known phosphoamino acid. Klumpp et al, Eur. J. Biochem. 269, 1067-1071 (2002) Protein Phosphorylation is of Fundamental Importance in Biological Regulation cca 10-30% of all proteins are phosphorylated * S, T, Y 1800 : 200 : 1 www.protein.sdu.dk * H ??? Bi7050 Fosfoproteom - Potížista * potlačení signálu v MS - pouze malá část z celkového počtu proteinů je fosforylovaná (přednostní ionizace nemodifikovaných peptidů) * většina signálních proteinů je v buňce v nízkých koncentracích * protein se může vyskytovat v různých fosfo formách * proteiny mohou být během zpracování defosforylovány fosfatázami přítomnými ve vzorku úprava vzorku obohacení pro-q phosphoproteins (Pro-Q Diamond , blue) proteins (SYPRO Ruby, red). (from the Molecular Probes website) Specifické barvení fosforylovaných proteinů, 2D GE Bi7050 alternativa Metabolické značení 32P měření radioaktivity immunoblotting phosphatase treatment phosphoproteins display a basic shift in their pI after the dephosphorylation. comparison 2D gels specific binding eluce Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) Bi7050 charging (Cu2+, Fe3+, Ga3+) IMAC enrichment of -Casein phosphopeptides (1 pmol of tryptic digest) Ziptip MC Bi7050 Technical note - Millipore Enrichment of phosphopeptides by TiO2 eluce změnou pH z posteru M.R. Larsena, HUPO, 2005 Bi7050 normal peptidy kaseinu fosfopeptidy kaseinu Maldi-MS Bez separace LOGO Kasein (1 ug) po digesci trypsinem Bi7050 Maldi-MS IMAC (Poros), Fe3+ Kasein (1 ug) po digesci trypsinem LOGO peptidy kaseinu fosfopeptidy kaseinu Bi7050 Maldi-MS TiO2 frakcionace Kasein (1 ug) po digesci trypsinem LOGO peptidy kaseinu fosfopeptidy kaseinu Bi7050 Bi7050 1070 1120 1170 m/z 500 1000 1500 2000 2500 a.i. 80 Da MALDI–MS spektrum peptidu bez a s fosforylací HRTSS*VPEY LOGO 1 x Phos 2 x Phos Digest kaseinu TiO2 MALDI-MS Potvrzení fosforylace pomocí alkalické fosfatázy Bi7050 Bi7050 ESI–MS (IT) spektrum peptidu bez a s fosforylací positive mode 165.0 226.8 285.1 334.7 380.1 408.2 447.7 495.0 538.3 569.3 640.4 668.3 873.5 916.9 1076.4 200 400 600 800 1000 1200 m/z 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 7 x10 Intens. m/z 538.3, 2+ m/z 578.3, 2+ 40 Da LOGO Scan Precursors Parked on marker CID Q1 Q2 Q3 Scan Q1 m/z Non-modified peptide PTM-bearing peptide Marker fragment Q1 scan Q3 fix Precursor Ion Scan Sken prekurzorů Bi7050 upraveno z materiálů ABI * kvadrupol Q1 analyzuje všechny ionty prekursorů, zaznamenány jsou jen prekurzory, z kterých vznikl fragmentací v kolizní cele (Q2) vybraný fragment s hledaným rozdílem v m/z * kvadrupol Q3 propouští na detektor pouze vybraný fragment (marker) Ø +204 for N-glycosylation (HexNAc) Ø +216 for Phosphotyrosine (pY immonium ion) Ø -79 for phosphorylation (PO3-) Marker fragment examples Scan Precursors CID Q1 Q2 Q3 Scan Q1 m/z Offset Scan “- “ Constant Neutral Loss Scanning examples ØΔ 49 for doubly charged phosphopeptides (Peptide2+-H3PO4) ØΔ 32.7 for triply charged phosphopeptides (Peptide3+-H3PO4) Bi7050 Constant Neutral Loss Scan Sken neutrální ztráty Q1 scan Q3 scan upraveno z materiálů ABI Non-modified peptide PTM-bearing peptide Marker difference * kvadrupol Q1 analyzuje všechny ionty prekursorů, zaznamenány jsou jen prekurzory, z kterých fragmentací v kolizní cele (Q2) vzniká fragment s odpovídající neutrální ztrátou (tj. nejčastěji Mprekurzor – Mneutrální molekula) * kvadrupol Q3 oproti Q1 skenuje s posunem odpovídajícím hmotnosti vybrané neutrální ztráty Fosforylace histonu H4 kinázou Aurora B (K. Nováková) • fosforylace • proteolytické štěpení trypsinem • frakcionace fosfopeptidů na TiO2 • LC-MS/MS analýza – sken neutrální ztráty (ETD) Schéma MS analýzy výběr prekurzorů dle intenzity MS/MS CID MS fragmentace vybraných prekurzorů std. fragmentační technikou výběr nových prekursorů detekce neutrální ztráty v CID MS/MS spektrech odpovídající ztrátě H3PO4 (49, 32.6) fragmentace prekurzoru vykazujícího ztrátu H3PO4 šetrnější fragmentační technikou ne detekce neutrální ztráty MS/MS ETD ano 5 10 15 20 25 30 35 Time [min] 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 6 x10 Intens. 1 5 10 15 20 25 30 35 Time [min] 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 7 x10 Intens. LC-MS chromatogram MS chromatogram vybraného iontu o m/z 559.0 TIC EIC 2. +MS, 21.9-22.1min #915-#923 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 5 x10 Intens. 557.0 557.5 558.0 558.5 559.0 559.5 560.0 560.5 561.0 561.5 m/z m/z 559.0 559.3 559.6 560.0 3+ 0.3 m/z 559.0 MS/MS spektrum, CID fragment 526.3, 3+ detekována neutrální ztráta 32.7 podezření na fosfopeptid m/z 559.0 MS/MS spektrum, ETD Biotools Score Score (Biotools) (Mascot) CID RKTVTAMDVVYALK 520 23 RKTVTAMDVVYALK 518 22 ETD RKTVTAMDVVYALK 6149 75 RKTVTAMDVVYALK 774 47 m/z Charge RT (min) Expect Mr 559.0 3+ 22.063 1674.0 Identifikace peptidu databázovým prohledáváním MS/MS Ion Search (MASCOT) MASCOT •gi|223582 Mass: 11230 Score: 74 Queries matched: 2 histone H4 Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Score Expect Rank Peptide 558.98 1673.93 1673.86 0.076 2 (23) 7.8 1 K.RKTVTAMDVVYALK.R + Phospho (ST) CID 558.98 1673.93 1673.86 0.076 2 75 5e-05 1 K.RKTVTAMDVVYALK.R + Phospho (ST) ETD Modifications: Optional: Phospho (ST) Search Parameter: Charge=2+ and 3+, MS Tol.:0.500000 Da, MSMS Tol.:0.500000 Da, Trypsin Mascot 2.2.03, NCBInr NCBInr_20081101.fasta m/z 559.0 MS/MS spektrum, CID RKTVTAMDVVYALK na základě CID MS/MS dat nelze fosfoskupinu lokalizovat RKTVTAMDVVYALK m/z 559.0 MS/MS spektrum, ETD na základě ETD MS/MS dat lze jednoznačně lokalizovat fosfoskupinu na T(3) T(3) x T(5) T3 + phospho (101 + 80) T5 (101) T3 (101) T5 + phospho (101 + 80) 403.3 c3 502.3 c4 M. Mann et al TRENDS in Biotechnology Vol.20 No.6 June 2002 Bi7050 Bi7050 a46 Bi7050 Ubikvitinace Ubiquitination is an enzymatic, protein post-translational modification (PTM) process in which the carboxylic acid of the terminal glycine from the di-glycine motif in the activated ubiquitin forms an amide bond to the epsilon amine of the lysine in the modified protein. Protein ubiquitination regulates many cellular processes including transcription, endocytosis, cellcycle control, signal transduction, stress response, DNA repair as well as proteasomal-mediated degradation * lokalizace modifikovaných AMK * určení vazeb v polyubikvitinu The most studied polyubiquitin chains - lysine48-linked - target proteins for destruction ubikvitin – protein 8.5 kDa (76 AMK) MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLV LRLRGG K heterogenita forem > N.J. Denis, Proteomics 2007, 7, 868–874 Bi7050 Strategie analýzy ubikvitinovaných míst D.Bustos, MCP, in press Schéma experimentu Bi7050 a77 Bi7050 Glykosylace one of the most common post-translational modifications of proteins in eukaryotic cells. involved in a wide range of biological functions such as receptor binding, cell signaling, immune recognition, inflammation, and pathogenicity. Základní typy glykanů: * N-linked * O-linked * GPI anchors http://www.expasy.ch/tools/#ptm Variation in the degrees of saturation at available glycosylation sites results in heterogeneity in the mass and charge of glycoproteins Signal Supression nlink olink N - linked O - linked Bi7050 glycans are attached to the protein backbone via an amide bond to an asparagine during protein synthesis N-linked glycosylations Bi7050 N-X-S(T) X nesmí být P subtypes: * High-mannose * Hybrid * Complex Bi7050 N-linked:High-mannose subtype b-D-Mannose b-D-N-Acetylglucosamine Bi7050 N-linked: Hybrid subtype a-N-Acetylneuraminic acid (Sialic Acid) b-D-Galactose Bi7050 N-linked: Complex subtype a-L-Fucose Bi7050 glycans are linked via the hydroxyl group of serine or threonine O-linked glycosylations examples: b-D-N-Acetylgalactosamine Bi7050 GPI (glycosylphosphatidylinositol) anchors anchors are linked via C-terminus, membrane bound proteins Bi7050 Charakterizace glykoproteinů * specifická detekce glykosylovaných proteinů * identifikace proteinů * určení glykosylačního místa * určení struktury glykanu Bi7050 Specifická detekce glykosylovaných proteinů Pro-Q Emerald 300 - glyko only Sypro Ruby - all další techniky detekce: kolorimetrická detekce fluorescenční detekce specifické obohacení: afinitní chromatografie (lektinové matrice. m-Aminophenylboronic Acid) identifikace proteinu: Peptide mapping MSMS Ion search Bi7050 chemická: Hydrazinolysis Hydrazine hydrolysis has been found to be effective in the complete release of unreduced O- and N-linked oligosaccharides. Alkaline b-Elimination - jen O-linked s vyjímkami Trifluoromethanesulfonic Acid - destrukce glykanu enzymatická: PNGase F N-linked, vše pryč, pokud ne PNGase A N-linked, vše pryč, pokud ne Endoglycosidase H N-linked, štípe až za prvním Endoglycosidase F1, F2, F3 N-linked, štípou specificky ke struktuře O-Glycosidase O-linked. vše pryč b-galactosidase štípe před ... Deglykosylace Bi7050 Určení místa glykosylace, resp. struktury glykanů * glykosylace „jen“ na S nebo T (O-linked) NXS(T) (N-linked) lze vytipovat potencionální glyko místa určité strukturní typy u glykanů (high-mannose....) * kombinace MS a MS/MS technik * * separace glykoproteinů resp. glykopeptidů * vhodná deglykosylační strategie Bi7050 MALDI-MS spectrum of glycosylated and non-glycosylated protein size of glycan part 30000 40000 50000 m/z 50 100 150 200 250 300 350 a.i. D = 2.8 kDa heterogenita Bi7050 glykosylovaný protein protein po deglykosylaci Endo Hf 1D GE of protein before and after deglycosylation confirmation of glycosylation Bi7050 MALDI-MS spectrum of deglycosylated protein confirmation of glycosylation Endoglycosidase Hf 30000 40000 50000 m/z 20 40 60 80 100 120 140 160 180 a.i. deglycosylated 30000 40000 50000 m/z 20 40 60 80 100 120 140 160 180 a.i. 30000 40000 50000 m/z 20 40 60 80 100 120 140 160 180 a.i. 35000 40000 45000 50000 m/z 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 a.i. Daver = 1.2 kDa MALDI-MS celých proteinů Bi7050 P5_all_zz MALDI-MS tryptických digestů * rozdílový peptid * stejný protein Bi7050 2900 3100 3300 3500 3700 3900 m/z 100 150 200 250 300 350 400 450 500 a.i. Detail spekter digestů proteinu před a po deglykosylaci PNGase A peptid 3966 zmizel objevil se peptid 2797, vedle peptidu 2795 * N-glykosylace * Daver = 1169 Da Bi7050 2770 2790 2810 m/z 100 150 200 250 300 350 400 450 500 a.i. Detail spekter digestů proteinu před a po deglykosylaci Bi7050 tryptický peptid 2796 Da …PHIFDYSGS… , kde D vzniká z N po deglykosylaci PNGasou A původní sekvence je tedy …PHIFNYSGS… (hmotnost 2795 Da) Peptid potvrzen také LCMSMS analýzou (v glykosylovaném vzorku digestu nebyl nalezen) Hmotnost glykanu 1170 Da odpovídá xylose+fucose+3*mannose+2*N-acetylglukosamin Nebyl dále potvrzen MSMS technikami Shrnutí výsledků Bi7050 …missing parts have potential N-glycosylation sites... • MLRNVCPVLILLIIGATAQDPTDVGEAFANVEWSVAELKRVLVMGVPRDCGELFLSGQNHSGVYNIYPYKDSLLPVSAYCDMETDGGGWTVFQRRGQFG NPVYYFYKKWADYAHGFGDPAKEYWLGNNVLHALTSDKAMSLRIEKNHSLETLTAEYSVFKVASEEEYFKINVGGYIGSK GSDAFSIANGSMFTASDQDHDTYTNNCAVEFKG AWYTSCHGSNLNGLNLNGEHPSYADGIEWSAR GGSTGLYYYSYPNVEMKVRDAHFISRVADGRAS from lecture of Petr Man Bi7050 2nd_site_MS hexose increments ... glycopeptide... MS/MS from lecture of Petr Man Bi7050 2nd_site_MS2 MS/MS from 1202.2 - – glycopeptide, type of glycan identified from lecture of Petr Man H – Hexose N – HexNAc Bi7050 2nd_site_MS3 MS/MS from 971.7 – peptide with one HexNAc – site of glycosylation identified from lecture of Petr Man b2 N(HexNAc)H y13 SLETLTAEYSVFK H – His N – Asn Bi7050 • MLRNVCPVLILLIIGATAQDPTDVGEAFANVEWSVAELKRVLVMGVPRDCGELFLSGQNHSGVYNIYPYKDSLLPVSAYCDMETDGGGWTVFQRRGQFG NPVYYFYKKWADYAHGFGDPAKEYWLGNNVLHALTSDKAMSLRIEKNHSLETLTAEYSVFKVASEEEYFKINVGGYIGSK GSDAFSIANGSMFTASDQDHDTYTNNCAVEFKG AWYTSCHGSNLNGLNLNGEHPSYADGIEWSAR GGSTGLYYYSYPNVEMKVRDAHFISRVADGRAS from lecture of Petr Man Bi7050 Bi7050 MALDI-MS spectrum of ribonuclease B 162 Da 163 Da glycan Bi7050 MS MS2 MS3 MS4 MSn of ribonuclease B glycans (AP-MALDI-IT MS) Bi7050 Kombinace deglykosidačních enzymů Bi7050 Postupná deglykosylace různými enzymy (MALDI-MS) a67