PŘÍPRAVA PROTEINOVÉHO VZORKU PRO MS ANALÝZU Hana Konečná Oddělení funkční genomiky a proteomiky ÚEB PřF MU www.sci.muni.cz/pVpKnb/ Rozvoj týmu pro výuku, výzkum a aplikace v oblasti funkční genomiky a proteomiky (CZ.1.07/2.3.00/09.0132) Středoevropský technologický institut CEITEC Centrální laboratoř - Proteomika GENOM PROTEOM PTM asi 200 typů (fosforylace, glykosylace, acylace, methylace…) KONCENTRAČNÍ ROZSAH asi deset řádů NUTNÁ FRAKCIONACE PŘED MS proteinový vzorek komplexní směs peptidů komplexní proteinový vzorek jednoduchý směs peptidů jednoduchá databáze identifikace kvantifikace 2D GE proteinové čipy LC MS MS/MS charakterizace modifikace I.I. Dvoudimenzionální elektroforéza 2-DGE ? Proteomický experiment extrakce fokusace SDS-PAGE digest MS identifikace neznámý protein HOMOGENIZACE • mechanicky • ultrazvukem • tlakem • zmražením / rozmražením • detergentovou lyzí PŘÍPRAVA VZORKU solubilizace močovina, thiomočovina, detergenty redukce DTT, TBP inhibice proteáz, fosfatáz, glykosyláz odstranění kontaminant žádný celkový náboj 0.5 – 4% použitelné ve vysokých koncentracích močoviny neionogenní zwitterointové SDS jen v nízkých koncentracích (do 0.25%) DETERGENTY CHAPS C7BzO E.coli KONTAMINANTY soli, zbytky pufrů malé endogenní molekuly iontové detergenty nukleové kyseliny polysacharidy lipidy fenolické látky 1. ROZMĚR IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE migrace nabitých částic v gradientu pH v elektrickém poli IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE • imobilizovaný pH gradient • amfolyty + + + - - - ROZSAH STRIPU ROZMĚR STRIPU ROZSAH STRIPU MW pI 3 - 10 NL pI 4 - 7 denaturace SDS • redukce DTT • alkylace IAA • EKVILIBRACE STRIPU 2. ROZMĚR SDS-PAGE migrace aniontů v elektrickém poli podle MW 2-DGE INSTRUMENTACE Protean IEF Protean Dodeca Cell Densitometer GS-800 FLA-7000, STORM PDQuest, Quantity One Protean Plus Dodeca Cell Mini-Protean 3 Dodeca Cell Protean II xi Cell DETEKCE PROTEINU • gel x blot • visualizace barvení radioaktivita imunodetekce • barvení v gelu • po elektroforéze • před elektroforézou • specifické pro protein • specifické pro PTM • viditelné spektrum • fluorescence Coomassie Blue R-250, Coomassie Blue G-250 Stříbro: kompatibilní s MS nekompatibilní s MS Sypro Ruby, Flamingo Pink, Lucy, Deep Purple Pro-Q Diamond, Pro-Q Emerald BARVENÍ PROTEINU V GELU 0.6 ng (8 ng) 36 ng 1 - 4 ng Stříbro Coomassie Sypro Ruby BARVENÍ PROTEINU – LINEARITA Sypro Ruby Ag Sypro Ruby • kvalitativní • kvantitativní ANALÝZA OBRAZU 2D or not 2D ? rozlišení vizuální aspekty multigelové jednotky dynamický rozsah extrémní proteiny (membránové,basické...) reprodukovatelnost, image analýza citlivost barvení pracnost nesnadná automatizace postdigesční extrakce Difference Gel Electrophoresis DIGE BIOMARKERY … jehly v kupce sena prefrakcionace separace identifikace srovnání kontrola vs.vzorek • seno - proteiny bez vztahu k onemocnění (pozadí) • jehly - specifické proteiny pro onemocnění • potenciální jehly jsou obtížně validovatelné • nejsou pravidla, které jehly dále zkoumat • jehly často PTM, nejsou identifikovány MS • hledání biomarkerů obtížné a neefektivní Den 21 – před klinickým projevem Den 44 – po klinickém projevu Biomarkery v lidské plasmě SEPARACE IDENTIFIKACE DIGESCE • IN-GEL • IN-SOLUTIONtrypsin Glu-C Asp-N thermolysin MAVEPFPRRPITRPHASIEVDTSGTGGSAGSSE KVFCLIGQAEGGEPNTVYELRNYAQAKRLFR SGELLDAIELAWGSNPNYTAGRILAMRIEDAK PASAEIGGLKITSKIYGNVANNIQVGLEKNTLS DSLRLRVIFQDDRFNEVYDNIGNIFTIKYKGEE ANATFSVEHDEETQKASRLVLKVGDQEVKSY DLTGGAYDYTNAIITDINQLPDFEAKLSPFGD KNLESSKLDKIENANIKDKAVYVKAVFGDLE KQTAYNGIVSFEQLNAEGEVPSNVEVEAGEES ATVTATSPIKTIEPFELTKLKGGTNGEPPATWA DKLDKFAHEGGYYIVPLSSKQSVHAEVASFV KERSDAGEPMRAIVGGGFNESKEQLFGRQAS LSNPRVSLVANSGTFVMDDGRKNHVPAYMV AVALGGLASGLEIGESITFKPLRVSSLDQIYESI DLDELNENGIISIEFVRNRTNTFFRIVDDVTTFN DKSDPVKAEMAVGEANDFLVSELKVQLEDQF IGTRTINTSASIIKDFIQSYLGRKKRDNEIQDFP AEDVQVIVEGNEARISMTVYPIRSFKKISVSLV YKQQTLQA MS 1 20 0 17 00 2 20 0 m/ z 50 0 1 00 0 1 50 0 2 00 0 2 50 0 a. i. Neoznačené píky: keratiny nebo autolýza trypsinu KERATINY ! ! ! Potlačení ionizace G I G O GARBAGE IN - GARBAGE OUT G I G O • R.M. Twyman: Principles of Proteomics • R.Westermeier, T.Naven, H-R Höpker: Proteomics in Practice • A.J.Link: 2D Proteome Analysis Protocols • Current Protocols in Protein Science • R.J.Simpson: Proteins and Proteomics • T.Rabilloud: Proteome Research: Two-dimensional Gel • Electrophoresis and Identification Methods • A. Görg, W. Weiss, M.J.Dunn: Proteomics 2004, 4, 3665, rev. • I. Miller, J. Crawford, E. Gianazza: Proteomics 2006, 6, rev. • F.Chevalier: Proteome Science 2010, 8:23, review • R. Burgess, M. Deutscher: Guide to Protein Purification LITERATURA II. PREFRAKCIONACE 10 000km 100km 10km 10cm 1 000km 1km 100m 10m 1m 1cm vzorek solubilizace deplece/obohacení 2D GE prefrakcionace digesce in-gel směs peptidů odsolení MALDI-MS ESI-MS ESI-MS/MS separace RP-HPLC nebo CE PMF fragmentační spektrum PST identifikace proteinu odstranění abundantních proteinů afinitní chromatografií HSA IgG ? ? ? interakce minoritních proteinů s abundantními ? ? ? AFINITNÍ DEPLECE Apolipoprotein Immunoglobulin kappa light chain Immunoglobulin light chain albumin Lidská plazma - vázaná frakce po afinitní depleci ALBUMIN IgG Barvení: CB G-250 PREFRAKCIONACE CPPL Combinatorial Peptide Ligand Library PROTEOMINER PREFRAKCIONACE MicroRotofor OffGel Fractionator IEF • prefrakcionace v roztoku • prefrakcionace na IPG stripu OFFGEL IEF prefrakcionace proteinů nebo peptidů MICROROTOFOR PREFRAKCIONACE MIKRO ROZSAHY pI GELOVÁ CHROMATOGRAFIE INSPIRATIVNÍ LITERATURA PRO MÍRNĚ POKROČILÉ Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: A tutorial Thierry Rabilloud et al. Journal of Proteomics 2011 Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: past, present and future Thierry Rabilloud et al. Journal of Proteomics 2010 Proteomic biomarker discovery: It's more than just mass spectrometry Josip Blonder et al. Electrophoresis 2011 Název prezentace v zápatí III. KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE LC MULTIDIMENZIONÁLNÍ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE MDLC • hyphenated on-line LC-MS • multidimensional LC-LC(-LC…) • shotgun proteomics protein digest peptide HPLC MS SLOVNÍČEK bottom-up • (příliš) mnoho peptidů • interference proteinů: stejná peptidová sekvence • většina systémů MDLC top-down • intaktní proteinový iont • limit velikosti - asi do 50 kDa Název prezentace v zápatí PROTEINY A PEPTIDY PRINCIPY SEPARACE KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ komplexnost abundance Název prezentace v zápatí CO ROZHODUJE KOLONA náboj hydrofobicita biospecifická afinita velikost molekuly ionex reverzní fáze afinitní gelová TYPY LC SEPARACE … a kombinace Název prezentace v zápatí IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE Název prezentace v zápatí RP CHROMATOGRAFIE reversed-phase chromatography Název prezentace v zápatí AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE Název prezentace v zápatí IMAC Immobilized Metal Affinity Chromatography PHOS Select Iron Affinity gel Kasein Kasein tryptic digest Surový Po aplikaci Surový Po aplikaci Název prezentace v zápatí HPLC FPLC PERFÚZNÍ LC Název prezentace v zápatí Kolona může vypadat různě . . . Název prezentace v zápatí C18 C4 MC SCX Zip Tip Millipore Glygen TopTip NuTip RP-MS obvykle poslední krok před MDLC-MS • monolitické kolony • vyšší tlak • vyšší teplota • optimalizace gradientu • značení stabilními izotopy optimalizace Název prezentace v zápatí MULTIDIMENZIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE kombinace odlišných fyzikálních a chemických separačních principů • SCX/RP • RP/RP • HILIC/RP • AC/MDLC fosfoproteiny a fosfopeptidy, glykoproteiny a glykopeptidy diskontinuální off-line kontinuální on-line 1. kolona 2.kolona dvoufázová kolona optimalizace parametrů MDLC ! Název prezentace v zápatí ProteomeLab PF 2D chromatofokusace RP Název prezentace v zápatí MULTIDIMENZIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE velké objemy vzorku možnost koncentrace na koloně membránové proteiny, basické proteiny není nutno barvit peptidy – přímé napojení na MS automatizace vizuální aspekty ztraceny: pI a Mr LC je sériová analýza GE může běžet současně pro více vzorků PROTI PRO LITERATURA - MULTIDIMENSIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE Hyphenated dimensions in separation science P.Q.Tranchida et al. Journal of Chromatography 2012 Multi-dimensional Liquid Chromatography in Proteomics Xiang Zhang et al. Anal Chim Acta 2010 Multidimensional separation of peptides for effective proteomic analysis H.J.Issaq et al. Journal of Chromatography 2005 Multi-dimensional liquid phase based separations in proteomics Hong Wang, et al. Journal of Chromatography 2003 Tato prezentace vznikla s podporou projektu OP VK Rozvoj týmu pro výuku, výzkum a aplikace v oblasti funkční genomiky a proteomiky (CZ.1.07/2.3.00/09.0132) For all the complex problems and difficult questions there is always one simple, easily comprehensible w r o n g answer.