Důležitost rovnováhy mezi signálními drahamiDůležitost rovnováhy mezi signálními drahami regulujícímiregulujícími apoptózuapoptózu a přežívánía přežívání –– ukázka na modelu nádoru tlustého střevaukázka na modelu nádoru tlustého střeva RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D. Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AV ČR přednáška 21.11.2012 Fyziologie buněčných systémů 2012 ApoptózaApoptóza -- geneticky kontrolovaný komplexní procesgeneticky kontrolovaný komplexní proces programované buněčné smrtiprogramované buněčné smrti -- cílenácílená sebedestrukcesebedestrukce buňkybuňky -- obrovský význam ve vývoji a udrženíobrovský význam ve vývoji a udržení homeostázahomeostáza mnohobuněčného organismumnohobuněčného organismu -- od 70. let intenzívní výzkumod 70. let intenzívní výzkum apoptózyapoptózy a její regulacea její regulace Hyršlová Vaculová A., 2012 Apoptóza – morfologické znaky bobtnáníbobtnání cytoplazmatickécytoplazmatické membrány,membrány, integrita membrány není porušenaintegrita membrány není porušena zmenšení velikosti buňkyzmenšení velikosti buňky kondenzace a specifická fragmentacekondenzace a specifická fragmentace jaderného chromatinujaderného chromatinu udržení integrity intracelulárních organeludržení integrity intracelulárních organel formace tzv.formace tzv. apoptotickýchapoptotických bodiesbodies Hyršlová Vaculová A., 2012 Apoptóza – biochemické změny Aktivace specifických molekulAktivace specifických molekul –– kaspázykaspázy, nukleázy atd., nukleázy atd. Nutné dodání energie ve formě ATPNutné dodání energie ve formě ATP Specifická fragmentace jaderné DNASpecifická fragmentace jaderné DNA Uvolnění specifických regulátorů zUvolnění specifických regulátorů z mitochondriímitochondrií Změny symetrie membránZměny symetrie membrán Hyršlová Vaculová A., 2012 ApoptózaApoptóza -- fyziologický významfyziologický význam Týká se jednotlivých buněkTýká se jednotlivých buněk Indukována fyziologickými stimulyIndukována fyziologickými stimuly FagocytózaFagocytóza makrofágymakrofágy Není zánětNení zánět Eliminace nepotřebných, poškozených,Eliminace nepotřebných, poškozených, nebezpečných, mutovaných či jinaknebezpečných, mutovaných či jinak pozměněných buněk za účelem udrženípozměněných buněk za účelem udržení homeostázyhomeostázy mnohobuněčného organismumnohobuněčného organismu Hyršlová Vaculová A., 2012 InduktoryInduktory apoptózyapoptózy Nedostatek růstových faktorůNedostatek růstových faktorů Hormonální změnyHormonální změny Specifické signály smrtiSpecifické signály smrti -- „„deathdeath ligandyligandy““ ChemoterapieChemoterapie UVUV--zářenízáření Ztráta kontaktu s prostředímZtráta kontaktu s prostředím Hyršlová Vaculová A., 2012 StudiumStudium apoptózyapoptózy vv mnohobuněčném organismumnohobuněčném organismu CaenorhabditisCaenorhabditis eleganselegans ((NematodaNematoda)) –– první aprvní a velmi sofistikovaný model studia PCDvelmi sofistikovaný model studia PCD Přesně řízený vývojPřesně řízený vývoj –– organismus z 1090organismus z 1090 buněk, z nich během vývoje 131 buněkbuněk, z nich během vývoje 131 buněk umíráumírá apoptózouapoptózou –– nutno přesné načasování anutno přesné načasování a lokalizace, jinak vážné malformacelokalizace, jinak vážné malformace Jeden z nejvíce studovaných organismů zJeden z nejvíce studovaných organismů z hlediska popisu mechanismůhlediska popisu mechanismů apoptózyapoptózy,, podobnost s obratlovci (výskyt analogickýchpodobnost s obratlovci (výskyt analogických apoptotickýchapoptotických genů a proteinů)genů a proteinů) Hyršlová Vaculová A., 2012 ApoptózaApoptóza ve vývojive vývoji mnohobuněčného organismumnohobuněčného organismu MetamorfózaMetamorfóza hmyzuhmyzu –– vývojvývoj imagaimaga z larvyz larvy MetamorfózaMetamorfóza obojživelníků a plazůobojživelníků a plazů –– ztrátaztráta ocasu pulců během proměny v žábu (postupnáocasu pulců během proměny v žábu (postupná řízená indukceřízená indukce apoptózyapoptózy a proměna tvarua proměna tvaru těla)těla) Hyršlová Vaculová A., 2012 ApoptózaApoptóza ve vývojive vývoji mnohobuněčného organismumnohobuněčného organismu odumírání některých neuronů při vytvářeníodumírání některých neuronů při vytváření CNSCNS formace tvaru orgánů a strukturformace tvaru orgánů a struktur –– prsty aprsty a interdigitálníinterdigitální prostoryprostory odstranění abnormalit během embryogenezeodstranění abnormalit během embryogeneze (včetně spontánních abortů)(včetně spontánních abortů) Hyršlová Vaculová A., 2012 ApoptózaApoptóza v regulaciv regulaci homeostázyhomeostázy organismuorganismu Eliminace starých diferencovanýchEliminace starých diferencovaných nepotřebných buněk (krevní, střevní,nepotřebných buněk (krevní, střevní, kožní…)kožní…) Eliminace již nepotřebných buněk mléčnéEliminace již nepotřebných buněk mléčné žlázy po ukončení laktacežlázy po ukončení laktace RegulaceRegulace endometriaendometria během menstruačníhoběhem menstruačního cyklucyklu Odumření poškozených zárodečných buněkOdumření poškozených zárodečných buněk Hyršlová Vaculová A., 2012 ApoptózaApoptóza versus proliferaceversus proliferace Pro udrženíPro udržení homeostázyhomeostázy organismu jeorganismu je nutná dokonalá rovnováha mezi procesynutná dokonalá rovnováha mezi procesy proliferace aproliferace a apoptózyapoptózy Porušení této rovnováhy máPorušení této rovnováhy má dalekosáhlé důsledky, které se odrazídalekosáhlé důsledky, které se odrazí na zdraví organismuna zdraví organismu Obzvláště nutné proObzvláště nutné pro intenzívnéintenzívné proliferujícíproliferující tkáně (krev, střevo…)tkáně (krev, střevo…) Hyršlová Vaculová A., 2012 Rakovina AIO AIDS neurodegenerativní onemocnění homeostáza apoptózaproliferace Hyršlová Vaculová A., 2012 ApoptózaApoptóza a nemocia nemoci –– stimulovaná vs. inhibovanástimulovaná vs. inhibovaná apoptózaapoptóza AIDSAIDS NeurodegenerativníNeurodegenerativní onemocněníonemocnění ((AlzheimerAlzheimer,,ParkinsonParkinson)) MyelodysplastickýMyelodysplastický syndromsyndrom IschemickéIschemické poškozenípoškození ((infakrtinfakrt,, reperfuzereperfuze)) Intoxikace jaterIntoxikace jater Nádorové onemocněníNádorové onemocnění AutoimunitníAutoimunitní onemocněníonemocnění Virové infekceVirové infekce (Herpes,(Herpes, AdenovirusAdenovirus)) Hyršlová Vaculová A., 2012 Modelový systém pro studiumModelový systém pro studium apoptózyapoptózy Střevní epitelStřevní epitel -- druhá nejintenzivnějidruhá nejintenzivněji proliferujícíproliferující tkáň v lidském organismutkáň v lidském organismu –– Extrémní důležitost přísné regulaceExtrémní důležitost přísné regulace cytokinetickýchcytokinetických procesů a jejich rovnováhy proprocesů a jejich rovnováhy pro udrženíudržení homeostázyhomeostázy –– DeregulaceDeregulace –– vývoj nádorového onemocněnívývoj nádorového onemocnění Nádorové onemocnění tlustého střevaNádorové onemocnění tlustého střeva -- studium mechanismů regulacestudium mechanismů regulace apoptózyapoptózy vv naší laboratořinaší laboratoři Hyršlová Vaculová A., 2012 Nádorové onemocnění tlustého střeva Nerovnováha mezi buněčnou proliferací, diferenciací a apoptózou – porušení homeostázy tkáně – podmínky pro rozvoj nádorového onemocnění - kolorektální karcinom vyvíjí se pomalu – nejprve benigní polypy – pak akumulace mutací (díky vysoké míře proliferace) a maligní zvrat počáteční stádia – dobře léčitelná (chirurgie, v raných fázích jedno z nejlépe léčitelných nádorových onemocnění) polovina nádorů CRC však zjištěna až v pokročilém stádiu (nedostatečný screening) vysoká incidence CRC v ČR – přední místo ve statistikách, neustálý alarmující nárůst možnost významně ovlivnit vývoj onemocnění složením výživy obrovský význam prevence! Hyršlová Vaculová A., 2012 Hyršlová Vaculová A., 2012 Buněčná kultura naBuněčná kultura na PetrihoPetriho miscemisce –– adherentníadherentní epitheliálníepitheliální buňky kolonubuňky kolonu Postupné uvolňování původně přisedlýchPostupné uvolňování původně přisedlých buněk do média,buněk do média, apoptózaapoptóza,, apoptotickáapoptotická tělískatělíska v umělév umělé in vitroin vitro kultuře nejsoukultuře nejsou přítomny fagocyty, aby je pohltily,přítomny fagocyty, aby je pohltily, může proto docházet k tzv.může proto docházet k tzv. sekundární nekrózesekundární nekróze Modelový systém pro studiumModelový systém pro studium apoptózyapoptózy –– in vitroin vitro Hyršlová Vaculová A., 2012 ATCC Hyršlová Vaculová A., 2012 KolorektálníKolorektální karcinogenezekarcinogeneze Maligní transformace normální střevní tkáněMaligní transformace normální střevní tkáně –– charakteristika:charakteristika: GetetickéGetetické změny:změny: akumulace mutacíakumulace mutací Abnormální dynamika střevní krypty:Abnormální dynamika střevní krypty: porušeníporušení rovnováhy mezi proliferací, diferenciací arovnováhy mezi proliferací, diferenciací a apoptózouapoptózou Deformace střevní krypty:Deformace střevní krypty: nadměrné hromaděnínadměrné hromadění buněk vede k výrazným změnám morfologie kryptybuněk vede k výrazným změnám morfologie krypty Formace polypů:Formace polypů: nahromadění buněk, benigní útvarynahromadění buněk, benigní útvary Progrese nádoru:Progrese nádoru: další akumulace genetických změn,další akumulace genetických změn, zvyšování malignity azvyšování malignity a invazivityinvazivity MetastázováníMetastázování:: CRCCRC metastázujemetastázuje převážně do jaterpřevážně do jater Hyršlová Vaculová A., 2012 KolorektálníKolorektální karcinogenezekarcinogeneze Nahromadění mutací nádorovýchNahromadění mutací nádorových supresorovýchsupresorových genů agenů a protoonkogenůprotoonkogenů běhemběhem kolorektálníkolorektální karcinogenezekarcinogeneze ((VogelsteinVogelstein etet alal.. 1988,1988, FearonFearon && VogelsteinVogelstein 1990)1990) Pro rozvoj maligního onemocnění jePro rozvoj maligního onemocnění je třeba kombinace několika různýchtřeba kombinace několika různých mutacímutací –– např. geny APC, DCC, p53….např. geny APC, DCC, p53…. ((HamiltonHamilton etet alal.. 1998)1998) Hyršlová Vaculová A., 2012 Významné změny střevních buněk běhemVýznamné změny střevních buněk během vývoje nádorového onemocněnívývoje nádorového onemocnění Zvýšená aktivace proliferačních aZvýšená aktivace proliferačních a antiapoptotickýchantiapoptotických signálních drah,signálních drah, zvýšená exprese některýchzvýšená exprese některých antiapoptotickýchantiapoptotických proteinůproteinů Změny citlivosti buněk kZměny citlivosti buněk k apoptózeapoptóze,, např.např. apoptózeapoptóze indukovanéindukované TRAILemTRAILem –– v procesuv procesu kolorektálníkolorektální karcinogenezekarcinogeneze Hyršlová Vaculová A., 2012 Význam TRAILu  Velmi výhodné vlastnosti (selektivní působení na nádorové buňky, indukce apoptózy nezávisle na p53) využití vvyužití v protinádorovéprotinádorové terapii jako důležitáterapii jako důležitá alternativa ke konvenčním léčebným postupůmalternativa ke konvenčním léčebným postupům využívajícím chemoterapii a ionizující záření (řadavyužívajícím chemoterapii a ionizující záření (řada nádorů rezistentních, dráha přesnádorů rezistentních, dráha přes mitochondriemitochondrie,, overexpreseoverexprese BclBcl--2)2)  Některé nádorové buňky jsou však rezistentní k apoptóze indukované TRAILem popis signálních drah TRAILu je proto velmi důležitý pro pochopení mechanismu působení, mechanismů rezistence a pro správné zacílení protinádorové terapie Hyršlová Vaculová A., 2012 Efektorové kaspázy Kaspáza-8 Kaspáza-9 Kaspáza-3 Prokaspáza-9 dATP Apaf-1 Cytochrom c Prokaspáza-8 Bid tBid Mitochondrie „Death“ substráty Buněčná membrána FADD TRAIL „death receptor“ Kaspáza-6 Mcl-1 Bcl-2 Bax Bak jádro DISC Hyršlová Vaculová A., 2012 PůsobeníPůsobení TRAILuTRAILu na nádorovéna nádorové buňky tlustého střevabuňky tlustého střeva TRAIL indukuje apoptózu nádorových buněk střeva in vitro v průběhu kolorektální karcinogeneze roste citlivost buněk k apoptotickým účinkům TRAILu (adenom vs. karcinom) (Hague et al., 2005) Popsána účinnost TRAILu rovněž v systému in vivo – inhiboval růst xenograftů (karcinom kolonu) u myší, bez vedlejších projevů systémové toxicity (Walczak et al., 1999) Hyršlová Vaculová A., 2012 Důležitost ROVNOVÁHDůležitost ROVNOVÁH Signální dráhy indukujícíSignální dráhy indukující --buněčnou smrtbuněčnou smrt --přežití buněkpřežití buněk Co rozhodne o výsledném osudu buňky?Co rozhodne o výsledném osudu buňky? Hyršlová Vaculová A., 2012 Dráha Ras/Dráha Ras/RafRaf/MEK/ERK/MEK/ERK MAPKMAPK -- mitogenmitogen--activated proteinactivated protein kinasekinase (MAPK)(MAPK) Klíčová dráha přenášející signály z receptorůKlíčová dráha přenášející signály z receptorů růstových faktorů do jádrarůstových faktorů do jádra Molekuly této dráhy mají důležitou funkci vMolekuly této dráhy mají důležitou funkci v regulaci proliferace, diferenciace aregulaci proliferace, diferenciace a apoptózyapoptózy Deregulace této dráhy mají dalekosáhlé důsledky aDeregulace této dráhy mají dalekosáhlé důsledky a byly pozorovány u řady onemocnění včetněbyly pozorovány u řady onemocnění včetně nádorovýchnádorových Konstitutivní aktivace této dráhy u vysokéhoKonstitutivní aktivace této dráhy u vysokého procenta nádorůprocenta nádorů Inhibitory těchtoInhibitory těchto kinázkináz jakojako protinádorověprotinádorově působícípůsobící léčivaléčiva –– testování různých typů, klinické zkouškytestování různých typů, klinické zkoušky Hyršlová Vaculová A., 2012 ERK – extracellular signal-regulated protein kinase, MAPK (mitogen-activated protein kinase) Regulace - proliferace - diferenciace - apoptózy Konstitutivní aktivace MAPKs je častým jevem u řady nádorových buněčných linií včetně kolonu (Hoshino et al., 1999) (Sorbera et al., 2002) U0126 Hyršlová Vaculová A., 2012 control U0126 TRAIL TRAIL+U0126 42/44 42/44 40 pERK ERK b-actin kDa - ERK1/2 konstitutivně aktivní u nádorových buněk kolonu - TRAIL významně indukuje fosforylaci ERK1/2 u buněk HT-29 - U0126 – inhibice bazální i TRAILem indukované fosforylace ERK1/2 Hyršlová Vaculová A., 2012(Vaculova et al., 2009) PosíleníPosílení apoptózyapoptózy indukovanéindukované TRAILemTRAILem vv podmínkách specifické inhibice dráhy MEK/ERKpodmínkách specifické inhibice dráhy MEK/ERK 113 89 kDa 1.80.3% 25.71.7% * 1.40.3% 38.54.8%*+x M30cytodeath M30cytodeath M30cytodeath M30cytodeath Štěpení CK18 (M30cytodeath, FCM) Štěpení PARP control U0126 TRAIL TRAIL+U0126 Hyršlová Vaculová A., 2012(Vaculova et al., 2009) Mcl-1 mRNA Mcl-1 protein 40Mcl-1 kDa control U0126 TRAIL TRAIL+U0126 40-actin *x * * 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 control TRAIL U0126 TRAIL+U0126 relativeMcl-1mRNAexpression Blokace dráhy MEK/ERK – inhibice exprese mcl-1 mRNA a proteinu Hyršlová Vaculová A., 2012(Vaculova et al., 2009) MclMcl--11 myeloidmyeloid celcel leukemialeukemia--1 protein, poprvé1 protein, poprvé identifikovaný u diferencujících myeloidníchidentifikovaný u diferencujících myeloidních buněk linie MLbuněk linie ML--11 (Kozopas(Kozopas etet alal., 1993)., 1993) AntiapoptotickýAntiapoptotický protein z rodinyprotein z rodiny BclBcl--22 Důležitý regulátorDůležitý regulátor mitochondriálnímitochondriální dráhydráhy indukceindukce apoptózyapoptózy InteragujeInteraguje ss proapoptotickýmiproapoptotickými proteinyproteiny rodinyrodiny BclBcl--2, inhibice2, inhibice apoptotickýchapoptotických změnzměn na úrovnina úrovni mitochondriímitochondrií (vylití(vylití cytochromucytochromu cc atd.)atd.) Hyršlová Vaculová A., 2012 MclMcl--11 Protein s velmi krátkým poločasemProtein s velmi krátkým poločasem rozkladurozkladu –– 30 minut až několik hodin30 minut až několik hodin (x např. protein(x např. protein BclBcl--2)2) Časný kritický regulátorČasný kritický regulátor apoptózyapoptózy,, krátkodobá ochrana buňky předkrátkodobá ochrana buňky před spuštěním buněčné smrtispuštěním buněčné smrti Účinná regulaceÚčinná regulace MclMcl--1 na mnoha1 na mnoha úrovních v buňceúrovních v buňce Hyršlová Vaculová A., 2012 MclMcl--1 a nádorová onemocnění1 a nádorová onemocnění OverexpreseOverexprese proteinuproteinu MclMcl--1 u řady nádorů1 u řady nádorů (NSCLC,(NSCLC, hepatocellularníhepatocellularní karcinom,karcinom, cholangiokarcinomcholangiokarcinom, jaterní metastázy CRC), jaterní metastázy CRC) (Song(Song etet alal. 2005,. 2005, SieghartSieghart etet alal. 2006,. 2006, OkaroOkaro etet alal. 2001,. 2001, BackusBackus etet alal.2001).2001) Zde zvýšená expreseZde zvýšená exprese MclMcl--1 může chránit1 může chránit nádorové buňky přednádorové buňky před apoptózouapoptózou Úloha proteinuÚloha proteinu MclMcl--1 v rezistenci buněk k1 v rezistenci buněk k protinádorovéprotinádorové terapii (CHT, záření…)terapii (CHT, záření…) –– MclMcl--11 antianti--sensesense,, siRNAsiRNA -- terapeutickéterapeutické strategiestrategie Hyršlová Vaculová A., 2012 ÚlohaÚloha poteinupoteinu MclMcl--1 v regulaci citlivosti1 v regulaci citlivosti buněk kbuněk k apoptózeapoptóze MclMcl--11 RNAiRNAi –– zcitlivění buněkzcitlivění buněk hepatocelulárníhohepatocelulárního karcinomu kkarcinomu k apoptózeapoptóze indukované působenímindukované působením chemoterapie a inhibitorů dráhy PI3K/Akt, ale ne kchemoterapie a inhibitorů dráhy PI3K/Akt, ale ne k apoptózeapoptóze indukovanéindukované TRAILemTRAILem (Schulze(Schulze--BergkammenBergkammen etet alal., 2006)., 2006) MclMcl--1 si RNA1 si RNA –– zcitlivění buněkzcitlivění buněk cholangiokarcinomucholangiokarcinomu kk apoptózeapoptóze inukovanéinukované TRAILemTRAILem ((TaniaiTaniai etet alal., 2004)., 2004) ProteinProtein MclMcl--1 hraje roli v regulaci citlivosti1 hraje roli v regulaci citlivosti nádorových buněk kolonu knádorových buněk kolonu k apoptózeapoptóze indukovanéindukované TRAILemTRAILem Hyršlová Vaculová A., 2012 MMP posílení apoptózy indukované TRAILem prostřednictvím U0126 na úrovni mitochondrií prostřednictvím eliminace Mcl-1 Hyršlová Vaculová A., 2012(Vaculova et al., 2009) ctrl TRAIL ctrl TRAIL ctrl TRAIL 2h 4h 8h Hyršlová Vaculová A., 2012(Vaculova et al., 2009) Specifická inhibice signální dráhy ERK1/2 významně zcitlivuje nádorové buňky tlustého střeva k apoptóze indukované TRAILem TRAIL rovněž může aktivovat dráhu ERK1/2TRAIL rovněž může aktivovat dráhu ERK1/2 a nárůst množství proteinua nárůst množství proteinu MclMcl--1 v buňkách1 v buňkách ((antiapoptotickéantiapoptotické působení!!), tyto efekty lzepůsobení!!), tyto efekty lze účinně inhibovat v podmínkách inhibiceúčinně inhibovat v podmínkách inhibice MEK/ERKMEK/ERK Úloha ERK v regulaciÚloha ERK v regulaci MclMcl--11 Hyršlová Vaculová A., 2012 Hyršlová Vaculová A., 2012 TRAIL aTRAIL a MclMcl--11 SpecifickáSpecifická downregulacedownregulace proteinuproteinu MclMcl-- 11 –– cesta k úspěšnému překonánícesta k úspěšnému překonání rezistence krezistence k apoptózeapoptóze indukovanéindukované TRAILemTRAILem Snaha připravit a použít inhibitory sSnaha připravit a použít inhibitory s minimem vedlejších účinkůminimem vedlejších účinků SorafenibSorafenib –– inhibitorinhibitor kinázkináz, specifická, specifická inhibice syntézy proteinuinhibice syntézy proteinu MclMcl--11 ((RicciRicci etet alal., 2008)., 2008) Hyršlová Vaculová A., 2012 PI3K/AktPI3K/Akt PI3K (PI3K (phosphatidylinositolphosphatidylinositol 33--kinasekinase)) –– lipidoválipidová kinázakináza, součástí signální dráhy, součástí signální dráhy tyrosinkinázovýchtyrosinkinázových receptorůreceptorů Stimulace proliferace, inhibiceStimulace proliferace, inhibice apoptózyapoptózy Konstitutivní aktivace u řady nádorůKonstitutivní aktivace u řady nádorů Inhibitory PI3K, Akt jako potenciálníInhibitory PI3K, Akt jako potenciální protinádorováprotinádorová terapeutikaterapeutika Aktivní PI3KAktivní PI3K fosforylujefosforyluje a tím aktivujea tím aktivuje kinázukinázu AktAkt (PKB), která má dále celou řadu substrátů, jenž se(PKB), která má dále celou řadu substrátů, jenž se podílejí na regulaci proliferace apodílejí na regulaci proliferace a apoptózyapoptózy Hyršlová Vaculová A., 2012 (Cooper GM, The Cell: A Molecular Approach.) Phosphatidylinositol 4,5BisPhosphate (PIP2) Phosphatidylinositol (3,4,5)trisphosphate (PIP3) phosphoinositide dependent kinase 1 (PDK1) Hyršlová Vaculová A., 2012 (Pondrom et al., 2005) Hyršlová Vaculová A., 2012 (Alberts et al., 2002, Molecular Biology of the Cell) Akt in regulation of cell survival/death Hyršlová Vaculová A., 2012 Akt (PKB)Akt (PKB) - Akt je jednou z nejčastěji aktivovaných protein kináz u nádorů, Akt může fosforylovat širokou škálu substrátů, z nichž některé hrají důležitou úlohu v karcinogenezi - Hyperaktivace Akt je spojena s rezistencí k apoptóze a zvýšenou buněčnou proliferací - buněčný homolog virového onkogenu vAkt - Akt spouští řadu antiapoptotických signálů: – inaktivuje proapoptotický protein Bcl-2 rodiny – Bad, - inaktivuje kaspázu 9, - brání vylití cytochromu c z mitochondrií, - reguluje hladinu proteinu FLIP, - fosforyluje NF-kappa B - Akt se podílí na stimulaci buněčného cyklu - reguluje stabilizaci některých cyklinů a transport inhibitorů kináz do jádra Hyršlová Vaculová A., 2012 PI3K/AktPI3K/Akt Velmi důležitá dráha v regulaci proliferace a diferenciace střevních buněk, zprostředkování signálů pro přežití (Sheng et al., 2003) významná role PI3K/Akt dráhy v regulaci citlivosti buněk k apoptóze indukované TRAILem – melanocyty (Larribere et al., 2004) – colon (Rychahou et al., 2005) Hyršlová Vaculová A., 2012 PosíleníPosílení apoptózyapoptózy indukovanéindukované TRAILemTRAILem vv podmínkách specifické inhibice dráhypodmínkách specifické inhibice dráhy PI3K/AktPI3K/Akt * *+x 0 10 20 30 40 50 60 K TRAIL LY294002 TRAIL+LY294002 %pozitivníchbuněk 113 89 PARP kDa caspase-8 41/43 55/57 control LY294002 TRAIL TRAIL+LY294002 Štěpení CK18 (FCM) Hyršlová Vaculová A., 2012(Vaculova et al., 2006) 40 60 Mcl-1 pAkt Akt b-actin control LY294002 TRAIL TRAIL+LY294002 40 60 * *+x 0 5 10 15 20 25 30 35 40 K TRA IL LY294002 TRA IL+LY294002 %buněksesníženýmMMP MMP (TMRE, FCM) Hyršlová Vaculová A., 2012(Vaculova et al., 2006) Specifická inhibice signální dráhy PI3K/Akt významně zcitlivuje nádorové buňky tlustého střeva k apoptóze indukované TRAILem V podmínkách inhibice PI3K/Akt seV podmínkách inhibice PI3K/Akt se nemění bazální, aninemění bazální, ani TRAILemTRAILem indukovaná hladina proteinuindukovaná hladina proteinu MclMcl--1 v1 v buňkáchbuňkách –– jiný mechanismus zcitlivění kjiný mechanismus zcitlivění k apoptotickýmapoptotickým účinkůmúčinkům TRAILuTRAILu ve srovnáníve srovnání s úlohou dráhy MEK/ERKs úlohou dráhy MEK/ERK Hyršlová Vaculová A., 2012 Hyršlová Vaculová A., 2012 EGFEGF Epidermální růstový faktorEpidermální růstový faktor Vazba na povrchový receptorVazba na povrchový receptor EGFREGFR Stimulace proliferace aStimulace proliferace a antiapoptotickýchantiapoptotických signálních drahsignálních drah Aktivace drah MEK/ERK aAktivace drah MEK/ERK a PI3K/AktPI3K/Akt Nadměrná stimulace této dráhyNadměrná stimulace této dráhy během nádorových onemocněníběhem nádorových onemocnění Inhibitory EGFR dráhyInhibitory EGFR dráhy –– potenciálně využitelná léčiva,potenciálně využitelná léčiva, aplikace v kombinované terapiiaplikace v kombinované terapii –– monoklonálnímonoklonální protilátky protiprotilátky proti EGFREGFR (Cooper GM, The Cell: A Molecular Approach.) Hyršlová Vaculová A., 2012 http://healthcare.sourcebioscience.com/diagnostic-tests/egfr Hyršlová Vaculová A., 2012 Molekuly zapojené v signální dráze EGFR, deregulované u CRC (Krasinkas et al., 2011) Hyršlová Vaculová A., 2012 EGF snižuje citlivost nádorových buněk tlustého střeva k apoptóze indukované TRAILem Hyršlová Vaculová A., 2012(Vaculova et al., 2009) Dráha EGFR vs. nádorové onemocněníDráha EGFR vs. nádorové onemocnění Vysoká exprese EGFR a posílená aktivace dráhyVysoká exprese EGFR a posílená aktivace dráhy EGFREGFR –– během progrese nádorových onemocněníběhem progrese nádorových onemocnění –– přispívá k rezistenci nádorů kpřispívá k rezistenci nádorů k chemochemo-- a radioterapii, kea radioterapii, ke zvýšené proliferaci nádorových buněkzvýšené proliferaci nádorových buněk Stimulace EGFRStimulace EGFR vede také k podpořevede také k podpoře neoangionegezeneoangionegeze a migrace buněka migrace buněk Blokace EGFR dráhyBlokace EGFR dráhy –– –– využití vvyužití v protinádorovéprotinádorové terapiiterapii syntetické inhibitory EGFRsyntetické inhibitory EGFR monoklonálnímonoklonální protilátkyprotilátky -- ErbituxErbitux Hyršlová Vaculová A., 2012 In cancer cells, activation of the EGFR or related pathways induces genes implicated in tumor progression. EGFR targeted therapies block the activation of this signaling pathway. http://www.krascanada.ca/en/detect.html Hyršlová Vaculová A., 2012 (Khambata-Ford et al., 2007) Hyršlová Vaculová A., 2012 http://erbitux.registry.cz/ Hyršlová Vaculová A., 2012 CetuximabCetuximab ((marketedmarketed underunder thethe namename ErbituxErbitux)) aa monoclonalmonoclonal antibodyantibody,, anan epidermalepidermal growthgrowth factorfactor receptorreceptor (EGFR) inhibitor(EGFR) inhibitor givengiven byby intravenousintravenous infusioninfusion forfor treatmenttreatment ofof metastaticmetastatic colorectalcolorectal cancercancer manufacturedmanufactured andand distributeddistributed inin NorthNorth AmericaAmerica byby ImCloneImClone andand BristolBristol--MyersMyers SquibbSquibb,, whilewhile inin thethe restrest ofof thethe worldworld distributiondistribution isis byby MerckMerck KgaAKgaA treatmenttreatment ofof patientspatients withwith EGFREGFR--expressingexpressing, KRAS, KRAS wildwild--typetype metastaticmetastatic colorectalcolorectal cancercancer (CRC), in(CRC), in combinationcombination withwith chemotherapychemotherapy,, andand as a single agent inas a single agent in patientspatients whowho havehave failedfailed oxaliplatinoxaliplatin-- andand irinotecanirinotecan--basedbased therapytherapy andand whowho areare intolerantintolerant toto irinotecanirinotecan.. inin mCRCmCRC,, biomarkersbiomarkers,, includingincluding KRAS, areKRAS, are indicativeindicative ofof response toresponse to cetuximabcetuximab ((ErbituxErbitux). 60%). 60% ofof patientspatients expressexpress thethe KRASKRAS wildwild--type tumortype tumor andand datadata havehave shownshown thatthat thesethese patientspatients areare significantlysignificantly moremore likelylikely toto benefitbenefit fromfrom treatmenttreatment withwith cetuximabcetuximab oror aa combinationcombination ofof cetuximabcetuximab plusplus chemotherapychemotherapy Hyršlová Vaculová A., 2012 (Zaftonte et al., 2000) Hyršlová Vaculová A., 2012 osud buňky jasně závisí na rovnováze proapoptotických a antiapoptotických drah roli hrají jak konstitutivně aktivované kinázy, tak ty, které jsou indukované působením apoptotického stimulu Hyršlová Vaculová A., 2012 Modulace aktivity signálních drahModulace aktivity signálních drah MEK/ERK a PI3K/Akt má významnouMEK/ERK a PI3K/Akt má významnou úlohu v regulaci citlivosti nádorovýchúlohu v regulaci citlivosti nádorových buněk k působeníbuněk k působení induktorůinduktorů apoptózyapoptózy - Inhibitory signálních drah MEK/ERK a PI3K/Aktsignálních drah MEK/ERK a PI3K/Akt Hyršlová Vaculová A., 2012 http://www.wistar.org/herlyn/therapy_MAPK.htm Hyršlová Vaculová A., 2012 (Schulze-Bergkammen, 2009) Hyršlová Vaculová A., 2012 důležitost klasifikace nádorových buněk s ohledem na odpověď k TRAILu před jeho terapeutickou aplikací důležitost současné aplikace inhibitorů „pro-survival“ kináz a TRAILu v protinádorové terapii pro optimální výsledek terapie u některých typů nádorů Hyršlová Vaculová A., 2012 ApoptózaApoptóza vs. léčba rakovinyvs. léčba rakoviny Možnost spustitMožnost spustit apoptózuapoptózu nádorovénádorové buňky je základní podmínkou úspěšnébuňky je základní podmínkou úspěšné protinádorovéprotinádorové terapieterapie Řada nádorových buněk je však vůčiŘada nádorových buněk je však vůči apoptózeapoptóze rezistentnírezistentní Je nutné objasnit mechanismyJe nutné objasnit mechanismy rezistence a překonat ji (nová léčiva,rezistence a překonat ji (nová léčiva, spuštění alternativních mechanismů,spuštění alternativních mechanismů, kombinovaná terapie, genová terapie…)kombinovaná terapie, genová terapie…) Hyršlová Vaculová A., 2012