Dezinfekce a sterilizace Mikroby a vnější vlivy Osa působícího faktoru U dekontaminačních metod je bezpodmínečně nutné dosáhnout takových hodnost působícího fyzikálního či chemického faktoru, aby došlo k usmrcení mikroba. Zajímá nás tedy primárně mez přežití, nikoli mez růstu (ta nás zajímá, když chceme mikroby kultivovat). Praktické ověření meze přežití a růstu nPokud chceme ověřit mez přežití bakterií, musíme je po odstranění testovaných extrémních parametrů přemístit do podmínek růstového optima a nechat je tam dostatečně dlouho (pokud byly jen inhibovány, tak se zvetí). nV opačném případě bychom ověřili pouze mez růstu, nikoli mez přežití (nedali bychom jim šanci se zvetit). RustPrez Nad čarou vždy působíme určitou teplotou 24 h Pod čarou jen 4 h, pak mikroby vrátíme do teploty optimální Mikroby a vnější vlivy II Někdy se účinek faktorů kombinuje Faktor, který se kombinuje vždy, je čas Rezistentní, sporulující bakterie 160 °C 170 °C 180 °C 20 min přežívá přežívá hyne 30 min přežívá hyne hyne 60 min hyne hyne hyne Faktor, který se vždycky kombinuje s ostatními: čas nVšimněte si: čím je teplota nižší, tím musí být delší čas, aby bylo dosaženo kýženého sterilizačního účinku. To je zohledněno i ve vyhlášce při stanovení parametrů pro parní a horkovzdušnou sterilizaci. Dekontaminační metody nJsou to fyzikální a chemické postupy likvidace mikrobů, hmyzu a hlodavců mimo organismus. (Někteří hygienici kladou metody k odstranění hmyzu a hlodavců zvlášť jako tzv. asanační metody) nMezi dekontaminační metody nepatří likvidace mikrobů v organismu, byť lokální (použití antiseptik). nAntiseptikum je lék. nDesinfekční prostředek není lék. Přehled dekontaminačních metod (Vyhláška 195/2005) Sterilizace Zničení všech mikrobů v daném prostředí Vyšší stupeň desinfekce Zničení naprosté většiny mikrobů, některé formy života mohou přežívat (cysty prvoků apod.) Desinfekce Zničení patogenních mikrobů (závisí na okolnostech) Desinsekce Zničení škodlivého hmyzu Deratizace Zničení škodlivých hlodavců Zásady správné dekontaminace (bez ohledu na typ metody) nVybrat vhodnou sterilizační/desinfekční metodu/prostředek. „Vhodný“ znamená: ¨musí bezpečně ničit (St) všechny organismy, resp. (Df) všechny, které připadají v.daném prostředí v úvahu ¨nesmí ničit desinfikovaný či sterilizovaný materiál ¨musí být prakticky použitelný nPoužít dostatečnou intenzitu faktoru (teplotu, intenzitu, koncentraci) nPříslušný faktor musí působit dostatečně dlouho n Před a po dekontaminaci nPřed dekontaminací je často nutná příprava – mechanické očištění, zajištění, aby dekontaminace správně proběhla. Tyto postupy opět přesně upravuje vyhláška nPo dekontaminaci je v některých případech nutno učinit určité kroky (např. odvětrat zbytek působící chemikálie). Je nutno dbát na pravidla uchovávání dekontaminovaných předmětů. nUchovávání dekontaminovaných předmětů (jak dlouho vydrží sterilní) rovněž upravuje vyhláška Dekontaminace a čištění nMechanicky špinavé nástroje je třeba před dekontaminací mechanicky omýt, jinak není dostatečně účinná Mytí a desinfekce Dezinfekce nA. FYZIKÁLNÍ METODY 1.Var: n a) za normálního tlaku – ve zdravotnictví alespoň 30 minut, ve zdravotnictví zakázáno n b) v tlakových hrncích – zkrácení času– ani v tom případě však nejde o sterilizaci 2.Jiné fyzikální metody: n filtrace (membránové filtry) n UV záření n plazma n atd. 2. nB. DEZINFEKČNÍ PROSTŘEDKY n 1. Oxidační činidla n a) Peroxosloučeniny: kyselina peroctová (CH3COOOH, u nás Persteril). Na spory, houby a tuberkulózu; 0,5% roztok = vyšší stupeň dezinfekce. Nevýhodou je agresivita, odbarvování textilií a nestabilita roztoků. n b) Peroxid vodíku (H2O2) – podobný, méně agresivní, také ale méně účinný. n 3% roztok- antiseptikum n c) Manganistan draselný- hypermangan (koupele, výplachy, kloktání), dnes se už nepoužívá n2. Halogenové preparáty n a) chlornany: ¨chlornan sodný (NaOCl), u nás Savo ¨chlornan vápenatý (Ca(OCl)2; chlorové vápno) n b) Chloramin (Chloramin B; Chloraminy BM a BS jsou s přísadami). n c) Jodová tinktura + novější Jodonal B, Jodisol a Betadine, kde je jód vázán v.komplexu. U nealergických pacientů by měl mít Jodonal B přednost před Ajatinem n3. Formaldehyd – ve směsích, dráždivý zápach, prostorová dezinfekce n4. Kresol (lysol) je účinný, pro zápach a agresivitu se již téměř neužívá. n5. Ethylalkohol – ve směsi, sám není příliš účinný; relativně nejúčinnější je asi 70 % roztok. n7. Tenzidy: Orthosan BF 12 n Ajatin – běžný pro desinfekci pokožky. n Septonex – spíše antiseptikum. n8. Anorganické kyseliny a louhy, těžké kovy aj. n9. Kombinované přípravky, např. Incidur Účinnost desinfekce na různé mikroorganismy nV příručkách a jiných materiálech se zpravidla používá abecední systém: nA = účinné na (vegetativní) bakterie a kvasinky nB = účinné na viry nC = účinné na bakteriální endospory nT = účinné na tuberkulózní mykobakteria nM = účinné na atypická mykobakteria nV = účinné na vláknité houby Vhodnost k různým účelům nNěkteré prostředky se hodí jen k něčemu: jsou třeba jen na povrchy, nebo jen na kůži. nZpravidla desinfekční prostředky dělíme na nprostředky na nástroje nprostředky na povrchy nprostředky na ruce (+ desinfekční mýdla) ndesinfekce potrubí v potravinářství ndesinfekce vhodná pro kuchyně Vyšší stupeň desinfekce n„něco mezi sterilizací a desinfekcí“ nna rozdíl od sterilizace nemusí zničit například cysty prvoků nebo vajíčka červů. nglutaraldehyd, Sekusept nebo Persteril nkoncentrace vždy jsou vyšší než pro běžnou desinfekci nU předmetů, které nelze podrobit sterilizaci (např. endoskopy) Sterilizace n1. Sterilizace horkou parou pod tlakem (autoklávování). Pára musí být právě nasycená. Hodí se na předměty ze skla, kovu, keramiky, kameniny, porcelánu, textilu, gumy a některých plastů. Teploty 121–134 °C. n2. Sterilizace horkým vzduchem (u přístrojů s.nucenou cirkulací vzduchu 180 °C 20 minut nebo 170 °C 30 minut nebo 160 °C hodinu). Hodí se na kovy, sklo, porcelán a kameninu n3. Sterilizace gama zářením: používá se většinou při průmyslové výrobě, např. rukavic na jedno použití. n4. Plasmová sterilizace ve vysokofrekvenčním elektromagnetickém poli (moderní metoda) n5. Chemická sterilizace parami formaldehydu nebo ethylenoxidem (musí být přesně dodržen postup). Používá se tam, kde nelze použít fyzikální metody. Kontrola, zda byla dekontaminace provedena, a kontrola její účinnosti nOrientačně – smyslově – např. pomocí charakteristického zápachu nStanovení skutečné koncentrace desinfekčních prostředků (chemicky) nChemická kontrola sterilizace využívá indikátorů, které při určité teplotě mění vlastnosti (např. zbarvení) nZpůsob biologický užívá odolné kmeny rodu Bacillus. Ty absolvují celý cyklus a pak se zjišťuje, zda přežily. Stanovení citlivosti bakterií na antimikrobiální látky, průkaz faktorů rezistence Druhy antimikrobiálních látek nLátky působící celkově: ¨Antiparazitární látky proti parazitům ¨Antimykotika proti kvasinkám a vláknitým houbám ¨Antivirotika proti virům ¨Antituberkulotika proti mykobakteriím ¨Antibiotika proti bakteriím (přírodního původu) ¨Antibakteriální chemoterapeutika také proti bakteriím, ale syntetická ¨V poslední době se stírají rozdíly mezi posledními dvěma nLátky působící lokálně: antiseptika Ještě dekontaminace, nebo už antimikrobiální látka? nHranice mezi dekontaminačními metodami a antimikrobiálními látkami je neostrá. nZpravidla se za dekontaminaci ještě považuje působení na neporušenou kůži. nAplikace do rány už znamená užití antimikrobiální látky (antiseptika) nDůsledky i legislativní: dekontaminační prostředky schvaluje hlavní hygienik, antimikrobiální látky (jako ostatní léky) SÚKL Působení vlivů na mikroby nPři dekontaminaci trváme na usmrcení mikrobů (mikrobicidní efekt) nPři užití antimikrobiálních látek můžeme počítat se spoluprací pacientovy imunity, proto obvykle stačí i mikrobistatický (inhibiční) účinek nToto však neplatí u akutních stavů či imunokompromitovaných pacientů, kde se snažíme o mikrobicidní působení vždy MIC a MBC nMIC – minimální inhibiční koncentrace je pojem, který se u antibiotik používá pro označení meze růstu (množení) mikroba nMBC – minimální baktericidní koncentrace se používá pro mez přežití bakterie. (Mluvíme pro jednoduchost jen o bakteriích. U virů by se použil pojem „minimální virucidní“ apod.) Primárně baktericidní a primárně bakteriostatická atb nPrimárně baktericidní jsou atb, kde MIC a MBC jsou si téměř rovny nPrimárně bakteriostatická jsou atb, u kterých se využívá hodnoty nad MIC, ale nikoli nad MBC (svou podstatou bakterie jen inhibují) nV praxi je třeba vyvarovat se použití bakteriostatických antibiotik u závažných akutních stavů, imunosuprimovaných pacientů apod. Primárně baktericidní a primárně bakteriostatická atb Baktericidní a bakteriostatická Mechanismy působení antibiotik nNa buněčnou stěnu (baktericidní) ¨Betalaktamová antibiotika (peniciliny, cefalosporiny, monobaktamy a karbapenemy) ¨Glykopeptidová antibiotika (částečně) nNa cytoplasmatickou membránu – polypeptidy (baktericidní) nNa nukleovou kyselinu – chinolony (baktericidní) nNa proteosyntézu: aminoglykosidy (baktericidní); makrolidy, tetracykliny, linkosamidy, amfenikoly (bakteriostatické) nNa metabolismus – sulfonamidy (bakteriostatické) Rezistence mikrobů na antimikrobiální látky nPrimární rezistence: všechny kmeny daného druhu jsou rezistentní. n Příklad: betalaktamová atb nepůsobí na mykoplasmata, která vůbec nemají stěnu. nSekundární rezistence: vznikají necitlivé mutanty, a ty při selekčním tlaku antibiotika začnou převažovat. n (Escherichie mohou být citlivé na ampicilin, ale v poslední době výrazně přibývá rezistentních kmenů) Mechanismy rezistence nMikrob zabrání vniknutí antibiotika do buňky nMikrob aktivně vypuzuje atb z buňky nMikrob nabídne antibiotiku falešný receptor nMikrob enzymaticky štěpí antibiotikum (například betalaktamázy štěpí betalaktamová antibiotika) nZnalost příslušného mechanismu nám umožňuje pokusit se na mikroba vyzrát Inhibitory betalaktamáz •Působíme-li samotným antibiotikem, je inaktivováno bakteriální betalaktamázou. amoxicilin (kys. klavulanová, sulbaktam,..) •Má-li však laktamáza na výběr atraktivnější substrát, zvolí si ho, a antibiotikum pak může nerušeně působit. ko-amoxicilin Inhibitory betalaktamáz vždycky nestačí nBohužel, inhibitory betalaktamáz zabírají jen u méně účinných typů betalaktamáz nExistují velmi silné, širokospektré betalaktamázy (viz také dále), u kterých inhibitory nestačí (ani při jejich použití není léčba spolehlivě účinná) Epidemiologicky významné rezistence nMRSA – methicilin rezistentní stafylokoky. Nevpouštějí do svých buněk oxacilin ani jiné betalaktamy. Mnohé MRSA jsou rezistentní také na další atb (makrolidy, linkosamidy). Citlivé zůstávají glykopeptidy (vankomycin, teikoplanin). nVRE – vankomycin rezistentní enterokoky. Snadno se šíří – enterokoky má spousta lidí ve střevě nProducenti ESBL (Extended Spectrum Beta Lactamase). G- bakterie (klebsiely, ale i E. coli aj.) mohou tvořit širokospektré betalaktamázy, kde ani účinek inhibitorů není dostatečný. Účinné bývají jen karbapenemy a někdy některá ne-betalaktamová atb. n „Antibiotická politika“, atb střediska nPoužívání širokospektrých antibiotik představuje selekční tlak – přežívají rezistentní kmeny bakterií nV zemích, kde se antibiotika používají volně, bývají vysoké počty rezistencí na antibiotika nU nás existují „volná antibiotika“, která mohou lékaři předepisovat volně, a „vázaná atb“, jež musí schvalovat antibiotické středisko nAtb střediska bývají zřizována při mikrobiologických laboratořích velkých nemocnic. Dělají i poradenskou činnost. Metody zjišťování citlivosti in vitro nZjišťování citlivosti in vitro = v laboratoři nNezaručí stoprocentní účinnost léčby nPřesto vhodné u většiny nálezů kultivovatelných patogenních bakterií lV běžných případech kvalitativní testy (citlivý – rezistentní) lV indikovaných případech kvantitativní (zjišťujeme MIC). Jde zpravidla o rizikové kmeny u rizikových pacientů. Difuzní diskový test nNa MH (nebo jiný) agar se štětičkou plošně naočkuje suspenze baktérie nPak se nanášejí tzv. antibiotické disky – papírky napuštěné antibiotikem nU standardní Petriho misky se používá zpravidla šest disků, někdy se dává ještě sedmý doprostřed nAtb difunduje z disku agarem dál nKoncentrace atb klesá se vzdáleností od disku (a tedy i jeho schopnost inhibovat) nPokud mikrob roste až k disku, nebo má jen malou zónu, je rezistentní (necitlivý) nJe-li kolem disku dost velká zóna citlivosti (větší než stanovená hranice), je citlivý. Difúzní diskový test v praxi: zóny se změří a porovnají s referenčními atbpsae21 www.medmicro.info E-testy nPodobné v principu difúznímu diskovému testu nMísto disku se však použije proužek nV proužku stoupající koncentrace atb od jednoho konce ke druhému (získáno díky speciální technologii – proto jsou tak drahé) nZóna není kruhová, ale vejčitá. nTest je kvantitativní nNa papírku je stupnice – jednoduché odečítání (viz obrázek na další obrazovce) E-testy – vyhodnocení nHodnota MIC se odečítá přímo na proužku – v.místě, kde okraj zóny protíná daný proužek etest etest www.uniklinik-ulm.de Mikrodiluční test nAtb je v řadě důlků v plastové destičce, koncentrace postupně klesá nNejnižší koncentrace, která inhibuje růst, představuje hodnotu MIC nV přiložené šabloně je zpravidla označen breakpoint. Je-li MIC nižší než breakpoint, je kmen citlivý. Je-li MIC vyšší, je rezistentní nJedna destička se zpravidla použije pro jeden kmen, např. 12 antibiotik, každé v 8 různých koncentracích (přesněji: dvanácté jen v.sedmi, rohový důlek vpravo nahoře je kontrola růstu) Mikrodiluční test – ukázka gauntFig2 Mikrodiluční test – odečítání nVe sloupcích 1, 3, 4 a 5 je hodnota MIC příliš vysoká než aby mohla být změřena. P3160025ux Pamatujte si: nV praxi sice porovnáváme zóny (měříme zónu v.milimetrech a porovnáváme s hodnotou referenční zóny), ale nepřímo vlastně porovnáváme koncentrace: MIC versus léčebná koncentrace (zvaná též breakpoint) Zjišťování faktorů rezistence nNěkdy je lépe speciálními metodami zjišťovat přítomnost konkrétních faktorů rezistence, např. betalaktamáz. nDůvody mohou být následující: ¨testování citlivosti nedává dostatečně spolehlivé výsledky (špatná difuse v difusním testu, antibiotikum nepracuje přímo, ale přes metabolit…) ¨chceme vědět, zda jde o resistenci určitého konkrétního typu (ESBL, ampC)